Optimización de las condiciones experimentales para cultivos primarios de enterocitos murinos

DI CLAUDIO FIORELLA; ORSINI LUCÍA; GRIGERA RAÚL; MUGLIA CECILIA; DOCENA GUILLERMO H.

Congreso; LVII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC) y LX REUNIÓN ANUAL de la Sociedad Argentina de Inmunología (SAI); 2012

El epitelio intestinal es un sistema altamente dinámico, de gran interés para estudios de toxicidad, patogenicidad, respuesta intracelular a diferentes estímulos, inflamación, etc. Sin embargo, en general las células epiteliales que se emplean para estudios in vitro son líneas que se obtienen a partir de células tumorales. En el presente trabajo se optimizaron las condiciones de cultivo de enterocitos de duodeno de ratón utilizando membranas sintéticas de colágeno para controlar la sobrevida. Se aislaron células epiteliales a partir de intestino de ratón mediante incubación con DTT y EDTA. Las células se incubaron en DMEM-Glutamax con 20% SFB y antibióticos sobre membranas de colágeno estriado o sobre plástico. Se monitoreó la viabilidad celular en el tiempo mediante recuento celular con azul de tripán, y por microscopía de fluorescencia con bromuro de etidio y naranja de acridina. Se caracterizaron las células mediante microscopía óptica, actividad de fosfatasa alcalina (FA), de lactato deshidrogenasa (LDH), y se evaluó la expresión génica de Lgr5 y Akp3. Luego de 24 horas en cultivo las células permanecieron adheridas a la membrana, manteniendo un fenotipo compatible con el de enterocitos, a diferencia de lo que ocurre sobre células incubadas sin membrana (P<0.01), formando arreglos ordenados tipo empalizada, siguiendo la simetría de las fibras de colágeno presentes en la membrana. Las células se mantuvieron viables, evidenciándose un aumento de los núcleos apoptóticos con el tiempo (7 ± 2 núcleos naranjas por campo microscópico al día 14 de cultivo vs 0,3 ± 0,2 al día 7; P<0,05), siendo productoras de FA (5 ±1 UA/mg), manteniéndose el valor de LDH en el sobrenadante de cultivo constante (1200 ± 100   UI). Las células se congelaron en nitrógeno líquido durante distintos tiempos y al descongelarlas y plaquearlas sobre la membrana de colágeno, se observó una muy alta tasa de sobrevida, un fenotipo conservado y una marcada capacidad de proliferación en cultivo. Estos resultados constituyen un importante aporte para el establecimiento de cultivos primarios de enterocitos murinos, y de esta manera poder crio-preservarlos y crecerlos para su empleo en ensayos de varios días de duración.