Protocolos de muestreos para el estudio de micromycetes

ANDREA I. ROMERO & CECILIA C. CARMARÁN

Recife, Brasil

Congreso; V Congreso Brasileiro de Micologia; 2007

Sociedad Brasilera de Micología

Protocolos de muestreos para el estudio de micromicetes Andrea I. Romero & Cecilia C. Carmarán UBA, FCEN, Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental, Ciudad Universitaria, Pabellón 2, 4to piso, Av. Guiraldes 2620, CP1428EHA, Ciudad Auton de Buenos Aires, Argentina. e-mail: romero@bg.fcen.uba.ar   Introducción Los métodos de muestreo tanto en Ascomycetes como en otros grupos han sufrido sucesivas transformaciones, desde la simple observación y recolección de ejemplares sin diseño de muestreos. Si miramos hacia atrás, es sencillo ver que en estudios de Biodiversidad los especimenes eran coleccionados principalmente mediante la exploración errática de los investigadores, así surgieron aquella obras con los nombre de " Icones fungorum”, “Icones fungorum de Java” (Berlese 1900-1905, Penzig & Sacc. 1904, Tulasne & Tulasne 1861-1865, etc). Posteriormente, se puede ver que esta situación varía hacía una exploración más exhaustiva de regiones determinadas, por ejemplo, “Hongos de Venezuela“ (Dennis, 1970, entre muchos otros) o, en la micobiota en un substrato en particular, ejemplo, “Hongos caña de azúcar” (Spegazzini, 1896, entre muchos otros). Sin embargo, sólo más recientemente vemos un pronunciado interés en fijar con antelación las pautas de la exploración a realizar, estos nuevos diseños tienden a incorporar las nuevas herramientas disponibles para favorecer la utilización posterior de la información generada (Google earth, GPS, etc). Actualmente se hace cada día más evidente la necesidad de trabajar sobre protocolos de recolección explícitos y diseños de muestreo detallados. Hoy es aceptado que el tipo de muestreo en estudios de Biodiversidad depende en gran medida de los objetivos de la investigación llevada adelante, de los organismos involucrados, y las limitaciones del terreno a ser estudiado. En micromicetes, generalmente por el tamaño y tipo de crecimiento de estos organismos, las técnicas de muestreo involucran estudios detallados en laboratorio, ya sea estudios de cultivo o de observaciones microscópicas del material. ¿Qué entendemos por micromicetes? Microhongos o micromycetes: se define como aquellos hongos que tienen estructuras de reproducción microscópicas (Kirk et al. 2001). Así es, que comprenden un grupo de organismos no natural que atraviesa los sistemas de clasificación del Reino Hongos y de otros organismos parecidos a hongos en Protistas, Chromistas, Myxomycota, los cuales primitivamente estuvieron clasificados como hongos. El único criterio que los reúne es el tamaño microscópico de sus estructuras de producción de esporas. A pesar de su falta de historia filogenética común, los micromicetes son agrupados porque ellos o sus estadios asexuales son coleccionados con las mismas técnicas. Incluimos los siguientes grupos: -Hongos anamórficos, hongos conidiales, este grupo no natural, comprende alrededor de 2600 géneros y 15000 especies, caracterizadas por la producción de esporas mitóticamente. Cuya gran mayoría se presupone que está relacionados con teleomorfos de Ascomycota y una minoría de Basidiomycota. -Asomycota división de hongos que incluye  3228 géneros conteniendo 32325 especies reconocidas (Kirk et al. 2001). En Ascomycota la gran mayoría son considerado micromicetes sin embargo, hay algunos que son macromicetes como algunas especies del género Xylaria, o del Orden Pezizales. Micromicetes saprofitos Estudios dirigidos a la confección de  inventarios en hongos Rossman et al. (1998) propone diseños para llevar adelante inventarios. Si estos estudios se aplican en una transecta temporal pueden ser utilizados para la evaluación de las especies en las categorías de UICN. Las áreas deberían ser delimitadas claramente, en lo posible deben ser georeferenciadas. Debería destacarse el por qué de la elección del área y ser identificados sus componentes biogeográficos. El diseño consiste en definir transectas de una longitud determinada, con una distancia especificada entre sí, en cada transecta se determinan unidades de muestreo (subparcelas) que consisten en círculos de una superficie determinada, a intervalos establecidos. Las transectas serán georeferenciadas por GPS. En un primer diseño se realizarán tres transectas por área y se definirá el número de unidades de muestreo a estudiar (Rossman et al. 1998). Se trata de coleccionar todos los microhongos sobre ramas, ramitas, y hojas dentro de la parcela, con las anotaciones de transectas y subparcela correspondientes y se guarda en bolsas apropiadas. Luego son examinados en el laboratorio con lupa para ver si están fértiles, se trata de identificar, se secan y se guardan en herbario. Para cada espécimen se anota sus respectivo sustrato: rama, ramita, etc. Como mínimo, el lugar debe ser inspeccionado 2 veces al año, en la mitad y al fina de la época de fertilidad. El objetivo de esta presentación es ilustrar algunos de estos tipos de muestreo presentando las técnicas utilizadas en el estudio de micromicetes saprofitos, que aportan información para inventarios y categorías de la UICN, información útil para detectar disturbios antropocéntricos y cuantificar su impacto (Müeller et al. 2004). También nos ocuparemos de procedimientos y protocolos usados en la recolección de micromicetes endofíticos en madera y en hoja En cualquier estudio de este tipo debe considerarse a priori el destino tanto de las colecciones de material seco como aquellas referidas a cultivos obtenidos. Se aconseja su depósito en colecciones reconocidas internacionalmente. Material y métodos Protocolo para estudiar Endofitos de madera Se realizarán 4 muestreos durante el año, dos en otoño y dos en primavera. En cada uno de los muestreos se colectarán seis fragmentos sanos por árbol, sobre un total de siete árboles(Rossman et al. 1998). Los fragmentos serán trasladados al laboratorio y procesados en el día. Cada fragmento será flameado brevemente sobre los extremos y luego éstos serán cubiertos con una lámina de plástico negro que será asegurada por medio de bandas elásticas, para acelerar el proceso de descomposición. Los fragmentos permanecerán tres meses en oscuridad y a 25 º C. Cumplido el período de incubación se realizarán dos cortes transversales de la zona media de cada fragmento de forma tal de obtener un disco de 1 cm de espesor. En condiciones de esterilidad el disco será dividido en dos mitades y de la cara interna se tomarán astillas que serán colocados en placas de Petri con medio de cultivo. El medio utilizado será extracto de malta (MEA) y se realizarán los repiques necesarios hasta obtener cultivos axénicos. Posteriormente se procederá a la identificación de las especies fúngicas obtenidas. El muestreo de endofitos deberá ser evaluado 1 año después de comenzado con el objetivo de determinar si las estrategia de muestreo debe ser o no, modificada. Protocolo para aislar Endofitos de hojas Se coleccionarán hojas de al menos 5 individuos de la especie elegida, incluyendo hojas basales y apicales, jóvenes y maduras, más hojas expuestas al sol y otras la sombra. Se las transportará al laboratorio en bolsa estériles de polietileno de tal manera que conserven la humedad y temperatura. (Rossman et al. 1998) En el laboratorio se realiza una esterilización superficial, efectuando un lavado en una secuencia de etanol-hipoclorito de sodio-etanol. Las hojas se cortan con escarpelo esterilizado en seis segmentos de 1-cm2 los cuales fueron transferidos a cajas de Petri, de 9 cm diam con Agar Extracto de Malta (MEA). Las cajas se incuban a 24°C por 6 semanas y examinan periódicamente. Los micelios que se van desarrollando se repican a tubos de ensayo en pico de flauta con MEA y conservados a 4°C. Identificación de los Hongos Se intenta ubicar las especies taxonomicamente mediante los: A) Estudios de caracteres morfológicos: Se examinan caracteres macróscopicos y microscópicos. B) Estudios de los Cultivos obtenidos Consideraciones finales Hemos intentado resumir algunas direcciones para planear pautas generales para diseñar protocolos de muestreos de micromicetes, sugeridas por diversos autores. Cabe destacar la necesidad de investigaciones bien planeadas con metas claramente establecidas. Ø      Estudios pilotos y pre-muestreos de los hongos son muy útiles para determinar la intensidad de muestreo requerida para lograr las metas de la investigación encarada. Ø      Estos estudios previos también brindan una idea de la situación a través del número de especimenes a ser encontrado y una idea de la dificultades taxonómicas del proyecto. Ø      El análisis de estos datos puede brindar información sobre la riqueza se un sitio, y complementariamente, evidencias para evaluar la eficiencia del muestreo. Ø      Los diseños de muestreos presentados buscan la obtención de datos estandarizados sobre la diversidad de micromicetes encontrados. En la actualidad, los inconvenientes mayores en los estudios de diversidad son la falta de taxónomos y de fuentes de identificación. No hay región en el mundo entero que se conozca la micobiota de manera equivalente al conocimiento de las plantas vasculares, condición en la que estaremos todavía por mucho tiempo.