Análisis de los niveles de expresión de diferentes proteasas en hojas senescentes de cebada (Hordeum vulgare L.)

CINTIA VELIZ; CARLA CAPUTO; CRIADO, M. VICTORIA; IRMA N. ROBERTS

Bshia blanca

Congreso; 4to Congreso latinoamericano de Cebada; 2013

La degradación de proteínas en los órganos vegetativos durante la etapa de senescencia es una condición necesaria para la efectiva removilización del nitrógeno (N) hacia las nuevas hojas o granos en desarrollo. En cebada todavía es muy poco lo que se conoce sobre las proteasas específicas de la etapa de senescencia. El objetivo de este trabajo fue analizar la expresión de seis proteasas (SAG12, PAP, CND41, SUBT, CPMIII y LeuAP) seleccionadas a partir de la bibliografía durante la senescencia foliar natural o inducida en plantas de cebada por RT-PCR. Las plantas se cultivaron en cámara de crecimiento, invernáculo o a campo. En el ensayo en cámara se trabajó con plantas cultivadas en macetas con vermiculita con un fotoperíodo de 16 h luz, radiación de 350 μmoles m-2 s-1 y una temperatura de 20-25ºC. Las plantas se regaron con solución nutritiva (Hoagland y Arnon 1950). A los 15 d después la siembra (DDS), se cortaron las ultimas hojas totalmente expandidas y las mismas se incubaron en contacto con una solución de metil jasmonato (MJ) 200 μM o agua, para inducir la senescencia. Las plantas de invernáculo se sembraron en macetas de 5 litros con una mezcla de vermiculita, suelo y perlita (1:1:1). En los riegos se alternó agua corriente y solución nutritiva. A los 125 DDS, se tomaron muestras de hojas no senescentes y senescentes. Las plantas cultivadas a campo se obtuvieron de lotes cultivados de la localidad de Junín, a los 112 (muestreo 1) y 138 (muestreo 2) DDS. Los niveles de ARN mensajero de las proteasas y dos genes control (actina y TEF1α) se determinaron por RT-PCR semi-cuantitativa o qRT-PCR en tiempo real. En el primer caso la intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ. En ambos casos, se consideró inducción de un gen cuando se midieron niveles de expresión de 1,5 veces o más respecto del control y se consideró represión niveles de expresión de 0,5 veces o menos respecto del control. En el ensayo de cámara, la incubación en oscuridad condujo a la inducción de SAG12, PAP, SUBT y CPMIII mientras que el tratamiento con MJ incremento la expresión de SUBT en 1,2 veces. No se observaron variaciones significativas en los niveles de expresión de LeuAP ni CND41. En el ensayo de invernáculo, cuatro de las seis proteasas analizadas (SAG12, PAP, SUBT y LeuAP) mostraron una fuerte inducción (3 a 6 veces) en hojas senescentes comparadas con las hojas no senescentes. Por otro lado la expresión de CND41 disminuyó con la senescencia (0,25) mientras que CPMIII no pudo ser detectada en estas muestras. Por último, en las hojas de plantas cultivadas a campo se observó que SAG12, PAP, SUBT, CPMIII y LeuAP se indujeron con el progreso de la senescencia, mientras que la expresión de CND41 se vio reprimida. Estos resultados demuestran que cinco (SAG12, PAP, SUBT, CPMIII y LeuAP) de las seis proteasas en estudio se asocian en forma positiva con el progreso de la senescencia foliar en cebada tanto en plantas jóvenes (senescencia inducida) como adultas (senescencia natural) siendo SUBT (una serín-proteasa) y PAP (una cisteín-proteasa) las enzimas con más altos niveles de expresión. En el caso de CND41 (una proteasa aspártica) nuestros resultados demuestran que esta enzima se asocia en forma negativa con el progreso de la senescencia, siendo su expresión de mayor importancia en tejidos verdes o no senescentes. La relación entre las serín-proteasas tipo subtilisina y la removilización de N ha sido previamente demostrada en plantas de trigo por nuestro grupo de trabajo mientras que la participación de PAP en dicho proceso ha sido recientemente sugerida por otros autores. Esta información junto con los resultados aquí reportados señalan a las proteasas SUBT y PAP como los mejores candidatos para continuar con el estudio de la proteólisis asociada a la senescencia en plantas de cebada.