Indigo Biosynthesis by Pseudomonas monteilii P26 Planktonic and Immobilized Cells

ARIAS, MARIANA; FERRERO, MARCELA; ALESSANDRELLO, MAURICIO

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología General; 2017

Resumen En el presente trabajo se optimizó la producción deíndigo a partir de indol utilizando suspensiones celulares de Pseudomonasmonteilii P26. La mejor condición obtenida se utilizó para producir índigousando células inmovilizadas en espuma de poliuretano. El mayor rendimiento deíndigo se produjo en las condiciones con menor concentración bacteriana tantoen suspensión como con células inmovilizadas.  1. Introducción El índigo es un colorante muy utilizado en laindustria textil y alimenticia (1). Su producción a escala industrial serealiza actualmente por síntesis química, la cual demanda una gran cantidad deenergía y genera subproductos tóxicos (2). La biosíntesis de índigo mediada pormicroorganismos puede ser una alternativa ecológica y económica para laproducción de este colorante. 2. Objetivo  El objetivo delpresente trabajo es evaluar la producción de índigo por Pseudmonas monteiliiP26 a partir de indol. En primer lugar se determinarán las condiciones óptimasde la biosíntesis de índigo en cultivos líquidos utilizando P. monteiliiP26 en suspensión. Luego, la mejor condición determinada se utilizará paraproducir índigo empleando el microorganismo inmovilizado por formación debiofilm sobre espuma de poliuretano. 3. Materiales y Métodos 3.1 Microorganismo Cultivos de P. monteilii P26 fueronrealizados rutinariamente en medio LB ( g/l: peptona, 10, extracto de levadura,5 y cloruro de sodio, 10) , inoculados a partir de un cultivo stock conservadoen glicerol 20% v/v  a -20 °C. Las incubacionesse realizaron a 30 °C en agitación (180 rpm). Máximo crecimiento se alcanzó en24 horas. 3.2 Producción de índigo a partir de células ensuspensión de P. monteilii P26 Suspensiones de P. monteilii P26 de distintasconcentraciones fueron incubadas por 4 días en presencia de indol, el cual fueagregado como una solución acuosa (2,5 mM) o como sólido. Las suspensionescelulares fueron obtenidas a partir de cultivos inoculados con colonias quehabían sido expuestas previamente a indol, o bien inoculados con cultivos stockconservados a -20 °C en glicerol 20% v/v. Se evaluó además la adición denaftaleno durante el cultivo como inductor de la producción de índigo. Elíndigo producido luego de la incubación fue extraído de las células bacterianasutilizando dimetilformamida y su concentración fue determinada porespectrofotometría.  3.3 Inmovilización de P. monteilii P26 enespuma de poliuretano   La inmovilización por formación de biofilm serealizó siguiendo dos estrategias: un cultivo continuo con una velocidad dedilución mayor que la velocidad de crecimiento del microorganismo y un cultivoen lotes secuenciales. La cuantificación del biofilm se realizó desprendiendola biomasa adherida al soporte y determinando la concentración de unidades formadorasde colonia de la suspensión resultante. 3.4 Producción de índigo a partir de célulasinmovilizadas Las células inmovilizadas fueron incubadas en unasolución de indol 2,5 mM en agitación por cuatro días. Luego de este tiempo, elíndigo acumulado en el biofilm fue extraído mediante lavados sucesivos conacetona. La concentración del bioíndigo fue determinada por espectrofotometría. 4. Resultados y discusión 4.1 Producción de índigo a partir de células ensuspensión de P. monteilii P26 La condición óptima de producción de índigo utilizandocélulas en suspensión se obtuvo al utilizar cultivos inoculados a partir delstock congelado, sin la adición de naftaleno como inductor y agregando el indolcomo una solución acuosa. Las suspensiones de menor concentración produjeronmayor cantidad de índigo que las suspensiones concentradas. 4.2 Inmovilización de P. monteilii P26 enespuma de poliuretano La concentración de P. monteilii P26inmovilizada fue de 3,00 x 107 y 1,40 x 1010  UFC/g soporte cuando la inmovilizaciónse realizó por cultivo continuo y por lotes secuenciados respectivamente. 4.3 Producción de índigo a partir de célulasinmovilizadas Utilizandocélulas inmovilizadas mediante cultivo continuo, la producción de índigo fue de9,12 µmol/g soporte o 3 x 10-7 µmol/UFC. En cambio, laproducción de índigo mediada por células inmovilizadas a través de lotessecuenciales fue de 6,10 µmol/g soporte o 4,36 x 10-10µmol/UFC. Puede observarseque tanto con células en suspensión como inmovilizadas la concentración celularjuega un papel importante en la producción de índigo, siendo favorecida, eneste caso, a menores concentraciones. Cuando la densidad celular es alta,probablemente la concentración de indol por célula es baja y esto podríaocasionar que el indol sea degradado en lugar de transformado a índigo. Aconcentraciones celulares bajas, la concentración de indol por célula es alta,por lo que probablemente el mecanismo de degradación de indol sea insuficientecomo medio de detoxificación, por lo que se favorece la transformación rápida aun compuesto menos tóxico: el índigo. Otro factor que puede explicar el por quéde la mayor producción de índigo a bajas concentraciones celulares puede ser lalimitación en oxígeno que podrían sufrir las suspensiones concentradas, lo queprodría inhibir la síntesis de índigo. De la misma manera, un biofilm másdelgado podría favorecer la producción de índigo por sobre un biofilm gruesodebido a la mejor transferencia de oxígeno que se produce en el primer caso. Futurosexperimentos apuntarán a dilucidar estas cuestiones de manera de optimizar másaún la producción de índigo con células inmovilizadas.  5. Conclusión En el presentetrabajo se optimizó la producción de índigo a partir de indol utilizandocélulas de Pseudomonas monteilii P26 en suspensión e inmovilizadas enespuma de poliuretano. La concentración celular fue determinante para lasíntesis de índigo siendo favorecida a una baja concentración de bacterias.     Referencias 1. Kim H, JangS, Kim J, Yang Y, Kim Y, Kim B, Choi K (2017) Biosynthesis of indigo in Escherichiacoli expressing self-sufficient CYP102A from Streptomyces cattleya. Dyes and Pigments 140: 29-35.2. Rebelo SLH,Linhares M, Simões MMQ, Silva AMS, Neves MGPMS, Cavaleiro JAS, Freire C (2014)Indigo dye production by enzymatic mimicking based on an iron(III)porphyrin.Journal of Catalysis 315:33?40.