Clonado y expresión de una lacasa de Thermus sp. 2.9 con potencial aplicación en la degradación de biomasa vegetal

NAVAS, L; ORTIZ, E. ; BENINTENDE, G. ; ZANDOMENI, R. ; MARIO CARLOS NAZARENO SAPARRAT; BERRETTA, M.

San Miguel de Tucuman

Simposio; X Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO Argentina 2015; 2015

REDBIO Argentina Asociación Civil

Clonado y expresión de una lacasa de Thermus sp. 2.9 con potencial aplicación en la degradación de biomasa vegetalNavas, L. 1,3; Ortiz, E. 1,3; Benintende, G. 1; Zandomeni, R. 1,3; Saparrat, M. 2,3. y Berretta, M1,3.1) Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMyZA), CNIA, INTA Castelar. 2) Instituto de Fisiología Vegetal (INFIVE)-UNLP.3) CONICETDiversos microorganismos sintetizan una gran variedad de enzimas con actividad sobre los componentes estructurales de la pared celular vegetal (celulosa, hemicelulosa y lignina). Estas enzimas son objeto de investigación en la actualidad para el desarrollo de bioetanol celulósico o de segunda generación. En particular, las lacasas, enzimas que catalizan la degradación de lignina, son atractivas como agentes de pretratamiento en el proceso de hidrólisis enzimática de la biomasa vegetal, incrementando la accesibilidad de los polisacáridos a las celulasas y hemicelulasas involucradas.Thermus sp. 2.9 es una bacteria termófila de crecimiento óptimo a 70°C, aislada por nuestro grupo de trabajo de aguas termales de la provincia de Salta. En un estudio previo se llevó a cabo la secuenciación y ensamblado del ADN de su genoma, lográndose identificar un gen codificante de una enzima extracelular con homología a lacasas. El estudio de esta enzima reviste gran interés dada la escasa información disponible sobre lacasas bacterianas en relación a la de lacasas fúngicas, y por la mayor termoestabilidad que presentan las enzimasde microorganismos termófilos en general.En este trabajo se sobreexpresó la lacasa de Thermus sp. 2.9 en E. coli, clonando la región que codifica la enzima madura (después del clivaje del péptido señal involucrado en su secreción). Se obtuvo una proteína de 50 kDa, acorde al peso molecular esperado, distinguible del total de proteínas del homogenato bacteriano separadas por SDS-PAGE.La actividad enzimática de la proteína se detectó a través de la oxidación de ABTS (2,2´-azino-di-[3-etilbenzotiazolina sulfonato]), siendo máxima la actividad a 75°C. Estudios de termoestabilidad permitieron determinar un 60% de actividad remanente luego de incubar la enzima durante 8 horas a 70°C.Este trabajo muestra que la expresión lograda del gen de la lacasa de Thermus sp. 2.9 en un microorganismo mesófilo produce una enzima con actividad a 70-75°C, que coincide con la temperatura óptima para el crecimiento de la bacteria de origen. Por lo tanto, esta enzima clonada representa un candidato prometedor para el pretratamiento de la biomasa lignocelulósica durante el proceso de obtención de bioetanol.