CARACTERIZACIÓN BIOCATALÍTICA DE TRES BAEYER-VILLIGER MONOOXIGENASAS BACTERIANAS

CECCOLI, ROMINA D.; BIANCHI, DARIO A.; RIAL, DANIELA V.

Rosario (Presentación Virtual)

Congreso; XXII Congreso y XL Reunión anual de la SBR; 2020

Sociedad de Biología de Rosario

Las Baeyer-Villiger monooxigenasas (BVMO) son flavoenzimas que catalizan la inserción de un átomo de oxígeno en el sustrato mientras que el otro átomo del oxígeno molecular se reduce a agua. Las cetonas son los sustratos típicos de las BVMOs, y su oxidación produce ésteres o lactonas mediante una reacción ambientalmente amigable (1). En el genoma de Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 detectamos siete posibles BVMOs tipo I. Clonamos y expresamos funcionalmente en Escherichia coli tres de estas flavoenzimas, que denominamos BVMO2, BVMO4 y BVMO5. Las mismas son filogenéticamente divergentes en un árbol inferido con secuencias de BVMOs tipo I. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las nuevas BVMOs con el fin de ampliar el conjunto de este tipo de biocatalizadores disponibles para aplicaciones sintéticas. Inicialmente, evaluamos su potencial biocatalítico en sistemas de células enteras desafiándolas con varias cetonas como posibles sustratos. Observamos que estas enzimas oxidan cetonas lineales, aromáticas, cíclicas y bicíclicas pero con diferentes preferencias. Luego, purificamos las BVMO2, BVMO4 y BVMO5 recombinantes a homogeneidad y realizamos su caracterización in vitro. Determinamos el coeficiente de absorción molar de cada una de estas enzimas e investigamos la dependencia de sus actividades con el cofactor, la temperatura (20 a 45 °C) y el pH (6,0 a 9,0). Determinamos los parámetros cinéticos en estado estacionario de las tres flavoenzimas de B. diazoefficiens para fenilacetona y heptan-3-ona, siguiendo el consumo de NADPH. Observamos que la eficiencia catalítica de BVMO2 fue similar para ambos sustratos, BVMO4 presentó buenos resultados con fenilacetona en las condiciones de ensayadas, y ambas cetonas fueron sustratos muy buenos para BVMO5. Así, de acuerdo a las selectividades y el perfil de sustrato obtenidos in vivo y el desempeño de cada enzima in vitro, proponemos un comportamiento complementario entre las tres BVMOs. Mientras que BVMO2 oxidó cetonas con estructuras variables, las BVMO4 y BVMO5 mostraron un perfil de sustrato más acotado con preferencia por cetonas lineales, y además, presentaron regioselectividades particulares para una cetona bicíclica evaluada (2). Por lo tanto, estas enzimas amplían nuestro conjunto de biocatalizadores para obtener diferentes regioisómeros de ésteres por oxidación de ciertas cetonas lineales, proporcionando alternativas amigables con el medioambiente para fines sintéticos. Financiado por CONICET y UNR, Argentina. 1) Ceccoli, RD, Bianchi, DA, Rial, DV (2014) Front. Microbiol., 5:25. 2) Ceccoli, RD, Bianchi, DA, Carabajal, MA, Rial, DV (2020) Mol. Catal., 486: 110875.