Caracterización de un sistema de dos componentes Baeyer-Villiger monooxigenasa tipo II

CECCOLI, ROMINA D.; RIAL, DANIELA V.; BIANCHI, DARIO A.; ZOCCHI, SOFÍA

Rosario

Congreso; XXIV Congreso y XLII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2022

Sociedad de Biología de Rosario

Las Baeyer-Villiger monooxigenasas (BVMOs) son enzimas que catalizan la inserción de un átomo de oxígeno en el sustrato, generalmente cetonas, para generar ésteres o lactonas. En particular, las BVMOs tipo II son sistemas de dos componentes formados por una flavina reductasa que reduce FMN y una subunidad monooxigenasa que oxida el sustrato a expensas del FMN reducido. Estas enzimas son sistemas interesantes para aplicaciones biocatalíticas debido a que pueden utilizar NADH en lugar del NADPH, que es más costoso. Previamente en nuestro laboratorio, identificamos y clonamos los genes que codifican para una monooxigenasa y una posible flavina reductasa que se ubican próximos en el genoma de Mycobacterium tuberculosis. En este trabajo, investigamos si estas enzimas pueden formar una BVMO tipo II funcional y presentamos la caracterización de este sistema mediante ensayos in vivo e in vitro. Primeramente, evaluamos la actividad biocatalítica del sistema mediante biotransformaciones empleando células de Escherichia coli recombinantes frente a la cetona modelo (±)‐cis‐biciclo[3.2.0]hept‐2‐en‐6‐ona en función del tiempo. Nuestros resultados indican que la BVMO tipo II de M. tuberculosis puede oxidar esta cetona bicíclica, siendo la monooxigenasa más activa en presencia de la reductasa. Además, subclonamos los genes para obtener las proteínas fusionadas a un hexámero de histidinas. Luego de varios intentos, la monooxigenasa recombinante fue insoluble e inactiva. La flavina reductasa fue purificada a homogeneidad y se evaluó su actividad in vitro mediante medidas espectrofotométricas. Se ensayó su actividad catalítica en función del pH y se determinaron sus parámetros cinéticos frente a NADH y diferentes flavinas. Observamos que la afinidad de la reductasa por FMN es mayor que la medida para FAD y riboflavina, indicando que esta actividad ocurre preferentemente a expensas de NADH y FMN. En conjunto, nuestros resultados sugieren que esta flavina reductasa podría ser un posible dador de FMN reducido para la monooxigenasa en estudio.