ROL DE LA PROTEINA PKC EN LA DISMINUCIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL TRANSPORTADOR CANALICULAR MRP2 PRODUCIDA POR TNFα

CIRIACI, NADIA; MEDEOT, ANABELA C.; ANDERMATTEN, ROMINA B.; RUIZ, MARÍA LAURA; SCHUCK, VIRGINIA S.; SANCHEZ POZZI, ENRIQUE J.

Buenos Aires

Congreso; XX Congreso Argentino de Hepatología 2019; 2019

Asociación Argentina para el estudio de la enfermedades del hígado

Introducción: En colestasis asociada a procesos inflamatorios, citoquinas tales como TNFα, IL1ß y IL6 median la desinserción de transportadores canaliculares, como Mrp2 y Bsep, provocando falla secretora biliar. En estudios previos observamos que la citoquina TNFα induce desinserción de Mrp2 mediante la activación de la vía intracelular MEK/ERK, donde especies reactivas del oxígeno (ROS), generados por la enzima NADPH oxidasa (NOX), actúan como señalizadores. Debido a que Bsep sufre alteraciones en su localización por acción de ROS-PKC, nos propusimos evaluar si PKC participa en la alteración funcional de Mrp2 por TNFα y si actúa en la vía NOX-ROS-MEK/ERK. Metodología: duplas aisladas de hepatocitos de rata (DAHR) se preincubaron 15 min con los inhibidores de PKC Go6976 (Go 1µM) o BisindolilmaleimidaII (Bis 100nM) y en presencia del inhibidor de MEK, PD980589 (PD 5µM). Por otro lado, DAHR se pretrataron 30 min con apocinina (APO 300µM), inhibidor de NOX, en conjunto con Go y Bis. Luego DAHR se incubaron con TNFα (6,25pg/ml, 20 min). Finalmente, se expusieron a clorometilfluoresceína diacetato (2,5µM, 15 min) cuyo metabolito, glutatión metilfluoresceína (GMF), es sustrato de Mrp2. Por microscopía de fluorescencia se determinó el % de DAHR que acumularon GMF en la vesícula canalicular (cVA) relativizadas al control como medida de actividad de Mrp2. Análisis estadístico aplicado: test One-Way ANOVA.Resultados: (% del control±EE, n=3-9) TNF-α redujo cVA-GMF (64±1a), mientras que la inhibición de PKC y MEK previno la disminución por TNFα: TNFα+Go (81±2a,b), TNFα+Bis (80±2a,b) y TNFα+PD (87±1a,b). La coinhibición de PKC y MEK produjo sumación de efectos: TNFα+Go+PD (105±5b,c) y TNFα+Bis+PD (95±2b,c). La disminución de cVA-GMF por TNFα se bloqueó parcialmente en presencia del inhibidor de NOX (TNFα+APO 84±2a,b), mientras que el cotratamiento con los inhibidores de PKC no demostraron efectos protectores de sumación: TNFα+APO+Go (87±1a,b) y TNFα+APO+Bis (80±6a,b). a vs control, b vs TNFα, c vs TNFα+PD, p