La vía de calcio/calmodulina/quinasa dependiente de calcio-calmodulina II participa en las alteraciones colestásicas inducidas por estradiol 17-ß-D glucurónido en duplas aisladas de hepatocitos de rata (DAHR): rol de los canales de calcio

ANDRÉS E ZUCCHETTI, GISEL S. MISZCZUK, ISMAEL R. BAROSSO,FLAVIA D TOLEDO, MARCELO G. ROMA, FERNANDO A. CROCENZI, ENRIQUE J. SÁNCHEZ POZZI

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso Argentino de Hepatología; 2013

Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades del Hígado

Estradiol 17-ß-D glucurónido (E), induce colestasis debido a que estimula internalización endocítica de transportadores canaliculares tales como la bomba exportadora de sales biliares (Bsep) y el transportador multiespecífico de aniones orgánicos (Mrp2). La activación de diferentes vías de señalización tales como PKC, PI3K, MAPKs y el receptor de estrógenos α han sido asociadas a esta alteración. Calmodulina interactúa con este receptor y potencia su activación. Concordantemente observamos que los efectos colestásicos de E requieren aumentos en los nivele de calcio intracelular y activación de la quinasa dependiente de calcio-calmodulina II (CamKII). Por lo tanto, evaluamos el rol de canales de calcio de diferente localización celular [membrana plasmática (MP) o retículo endoplasmático (RE)] en las alteraciones inducidas por E. La actividad de transportadores canaliculares se evaluó en un modelo de duplas aisladas de hepatocito de rata (DAHR): DAHR se pre-incubaron 15min con distintos inhibidores de canales de Ca2+ y de la vía estudiada: Verapamilo, Nifedipina (V, 10µM o N, 0,3nM, bloqueantes de canales tipo L de MP), Dantroleno (D, 1µM, inhibidor del receptor de rianoidina en RE), 2-Aminoetil difenilborinato (2-Am, 4µM, Inhibidor del receptor de inositol-3-fosfato en RE), Trifluoroperazina (T, 10µM, inhibidor de calmodulina), W7 (100µM, inhibidor de calmodulina) y KN62 (KN, 1µM, inhibidor de CamKII). Luego se incubaron 20 min con E (100µM). Finalmente DAHR se expusieron a colil-glicil-amido-fluoresceína (sustrato de Bsep, CGamF 0,3µM) o CMFDA (2,5µM, intracelularmente convertido en glutatión-metilfluoresceína, GMF sustrato de Mrp2). Las DAHR acumulando fluorescencia en sus vacuolas canaliculares se contaron en microscopio de fluorescencia determinándose el porcentaje de las mismas (%AvC). La activación de CaMKII se evaluó en el modelo de hepatocitos aislados cultivados en una doble capa de colágeno en configuración sándwich (HRCS): HRCS cultivados por 5 días se expusieron a E (200µM) por 20min en presencia o ausencia de los inhibidores antes mencionados. Se realizaron western blots de las muestras usando anticuerpos contra la forma fosforilada y total de CaMKII. Los resultados fueron expresados como media±SD. Control E E+V E+N E+DN E+AM E+TFP E+W7 E+KN %AvC CGamF 100±0 50±2a 77±3b 76±7b 73±4b 79±3b 86±5b 87±6b 74±3b %AvC GMF 100±0 55±3a 79±6b 75±1b 76±4b 73±2b 89±3b 87±5b 82±3b Fosfo CamKII/CamKIItotal (unidades arbitrarias) 100±0 173±9a 105±15c 98±7c 195±24a 106±3c 107±12c 117±16c 109±5c a diferente de Control. b diferente de Control y E. c diferente de E (p