Participación de AKAP350 centrosomal en la migración de células HepG2.

TONUCCI, FACUNDO; MATTALONI, STELLA; FERRETTI, ANABELA C.; FAVRE, CRISTIAN; LAROCCA, MARIA CECILIA

ROSARIO

Congreso; Reunión Anual 2012 de la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS); 2012

AKAP350 (AKAP450 o CG-NAP) es una proteína de anclaje de PKA que tieneun rol fundamental en la nucleación de microtúbulos en el aparato deGolgi y en los centrosomas. Ambas organelas intervienen en la polarizaciónde células epiteliales, tanto durante el desarrollo de la polaridad apico-basolateral,como en la adquisición de un fenotipo migratorio en la transiciónepitelio-mesenquimal. Estudios previos de nuestro y otros grupos indicanque AKAP350 es clave para la adquisición de la polaridad apical en célulasHepG2 y en la migración direccionada en las células epiteliales RPE1, y quelos mecanismos implicados involucran la nucleación de microtúbulos porel aparato de Golgi. Nuestro objetivo en este trabajo fue estudiar la participaciónde AKAP350 centrosomal en la biogénesis canalicular y en la migraciónde células HepG2. Establecimos líneas celulares que expresan el dominiode localización centrosomal de AKAP350 fusionado a GFP (AKAP350CTD) exclusivamente en centrosomas, lo que induce el desplazamiento deAKAP350 de esta organela. Realizamos el análisis cuantitativo de imágenesobtenidas por microscopía confocal de fluorescencia con el fin de evaluarla formación de estructuras canaliculares (canalículos/100 células) en célulasAKAP350 CTD comparadas con células que expresan sólo GFP (Control).Estos estudios revelaron que la deslocalización centrosomal de AKAP350no alteró la formación de canalículos (Control 17±3; AKAP350 CTD 20±4).Por otro lado, estudiamos la migración de células HepG2 mediante ensayosde “Wound Healing”, evaluando el porcentaje de cierre de la herida alas 40 hs. Generamos células con disminución de la expresión de AKAP350utilizando RNA de interferencia (AKAP350 KD) en las que comprobamosque, tal como fuera descripto para células RPE1, AKAP350 interviene enla migración de las células HepG2 (Control 19%±1; AKAP350KD 14%±2*).El análisis de la respuesta de las células AKAP350 CTD en los ensayos de“Wound Healing” indicó una inhibición del 50% en el cierre de la herida(Control 21%±2; AKAP350 CTD 10±2*). Con el fin de confirmar la participaciónde AKAP350 centrosomal en la migración celular, evaluamos enforma conjunta el comportamiento de células controles y AKAP350 CTDdurante los ensayos de “Wound Healing”, mediante microscopia confocalde fluorescencia. Nuestros resultados mostraron una relación de célulasAKAP350 CTD /Control en el “leading edge” significativamente menor queen el resto de la monocapa celular (Monocapa: 1,0±0,3; “leading edge”:0,3±0,2*). Estos datos en suma indican que AKAP350 centrosomal participaen la migración direccionada en células HepG2. Nuestros próximosestudios se orientarán a analizar si AKAP350 centrosomal interviene en elposicionamiento correcto del aparato de Golgi durante el establecimientode la polaridad antero-posterior en células migratorias. * p 0,05