ESPECTROMETRIA DE MASAS COMO HERRAMIENTA PARA EL ANALISIS DE LA ESPECIFICIDAD DE FITOPEPTIDASAS

TORRES, MARÍA JOSÉ; TREJO, SEBASTIÁN ALEJANDRO; LÓPEZ, LAURA MARÍA ISABEL

Puerto Vallarta

Congreso; XVII Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería; 2017

Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería

El látex de Vasconcellea quercifolia (Caricaceae) contiene diferentes endopeptidasas cisteínicas con elevada actividad proteolítica que han sido empleadas para obtener hidrolizados de proteínas alimentarias (1). El sistema proteolítico contiene al menos siete proteasas diferentes de las cuales dos han sido purificadas y fueron denominadas Quercifoliaína I y II. Con el objeto de conocer la especificidad de sustrato de dichas fitopeptidasas los péptidos obtenidos luego de la hidrolisis de la cadena B de insulina fueron analizados por espectrometria de masas/ MALDI TOF.Metodología.Digestión de la cadena B de insulina.Las reacciones se llevaron a cabo a pH 8 en buffer Tris-HCl 0,05 M conteniendo cisteína 20 mM como activador, manteniendo una relación molar de enzima-sustrato 1:500. Se tomaron muestras a diferentes tiempos (0, 5, 20, 90 min y 16 h) para ser analizadas por MALDI-TOF MS en una placa MP 384 Ground Steel, Brucker siendo previamente cristalizadas sobre ésta con una matriz de HCCA. La reacción se detuvo mezclando 2 μl de la mezcla y 8 μl TFA 0,1% (v/v). Para poder establecer la especificidad de corte las masas de los péptidos obtenidos (masas observadas) se compararon con las masas correspondientes a los iones identificados dentro de la secuencia de la cadena B de la insulina (masa hallada) utilizando el programa GPMAW v6.0 que permitió identificar los péptidos generados a diferentes tiempos de digestión.Resultados.La acción proteolítica de Quercifoliaína I sobre la cadena B de insulina permitió establecer, a partir del análisis por espectrometría de masas de los productos obtenidos, sólo tres puntos de corte luego de 18 hs de incubación, de los cuales dos resultaron ser los mismos que los generados por papaína (2). La especificad de la enzima está restringida a la presencia de glicina y alanina en posición P1. Este comportamiento es similar al hallado para la glicilendopeptidasa (EC 3.4.22.25) aislada del látex de Carica papaya, cuya especificidad está prácticamente restringida a residuos de Gly en posición P1´, en contraste con las otras tres endopeptidasas de papaya (papaína, quimopapaína y caricaína) que exhiben una amplia especificidad de corte. En el caso de Quercifoliaína II luego de 18 hs de hidrolisis la proteasa digirió ampliamente la cadena B de la insulina y a todos los péptidos de entre 1000 y 3500 Da que se habían generado al principio de la reacción. Se identificaron un total de trece sitios de clivaje de Quercifoliaína II sobre el sustrato, seis de ellos resultaron ser los mismos que los generados por papaína, para la cual se identificaron siete sitios de cortes sobre la cadena B de la insulina.Conclusiones.De acuerdo a los resultados obtenidos y de su comparación con los obtenidos para papaína podemos concluir que Quercifoliaína I posee elevada especificidad, característica muy importante que la transforma en una enzima de gran interés biotecnológico. Por su parte Quercifoliaína II manifiesta baja especificidad, tratándose entonces de una proteasa que exhibe un amplio rango de corte.