Inmovilizaci´on orientada de proteinas en nanocanales de membranas track-etched

CONSTANZA AGUIAR; FLORENCIA RICHIERI; SILVIA SOTO ESPINOSA; MARIANO GRASSELLI

Cordoba

Encuentro; Nanocordoba 2014; 2014

Universidad Nacional de Cordoba

La nanotecnolog´ıa es un ´area en constante crecimiento, con aplicaciones pioneras en biomedicina, y puede ofrecer un sinf´ın de herramientas innovadoras para suplir las diversas demandas actuales que presentan las t´ecnicas empleadas en el estudio de prote´ınas. La interacci´on entre la nanotecnolog´ıa y la qu´ımica de prote´ınas podr´ıa tener numerosas ventajas sobre las t´ecnicas convencionales de an´alisis; como ser la reducci´on de volumen de muestras requeridos, cantidad de reactivos y hasta tiempo del ensayo, lo que conlleva a una mayor sensibilidad y simplicidad. La inmovilizaci´on de prote´ınas sobre distintos materiales es un procedimiento de sumo inter´es para diversos campos, entre ellos los materiales para diagn´ostico. La inmovilizaci´on covalente y monopuntual permite mejorar diferentes aspectos de los nanosistemas, como la sensibilidad y estabilidad de los dispositivos. Sin embargo, la mayor´ıa de los reactivos tienen un alto costo respecto de la fisisorci´on. Una reacci´on de inmovilizaci´on interesante es la qu´ımica del epoxi/tiol, que presenta una alta estabilidad qu´ımica y ocurrencia a condiciones fisiol´ogicas. El tiol est´a presente en las ciste´ınas, amino´acido poco com´un en las prote´ınas, con lo cual el agregado ex profeso del mismo en la secuencia proteica permite obtener sistemas a medida. En trabajos anteriores de nuestro Laboratorio se logr´o la modificaci´on de nanocanales de membranas tracketched de PET con poli-glicidil-metacrilato (pGMA), que le confiere a los mismos una superficie con grupos ep´oxidos reactivos expuestos. Una de las ventajas de utilizar estas membranas es que los nanocanales aumentan la superficie en la cual las prote´ınas pueden ser inmovilizadas, sin alterar de manera importante la transparencia del material. Para la preparaci´on de las membranas se utilizaron films PET de 23 um de espesor, irradiados con iones pesados acelerados de Kript´on en un ciclotr´on. La formaci´on de los poros se realiza por sensibilizaci´on de la traza con UV y posterior comido (etching) en una soluci´on de NaOH 2 M a 60# C por 25 min. La posterior modificaci´on por injerto se realiza incubando en una soluci´on de GMA 10% (etanol/agua 1:1) inmediatamente despu´es deletching, seg´un se describe en un trabajo previo de nuestro laboratorio (Soto Espinoza et al, 2014). Las membranas modificadas fueron luego incubadas en bu↵er fosfato salino con la Green Fluorescent Protein-Cys 1(GFP-Cys1), una prote´ına fluorescente recombinante que contiene un tag N-terminal de seis amino´acidos, dentro de los cuales se encuentra una ´unica Cys libre. La presencia de la prote´ına en el material se determin´o utilizando un espectrofluor´ometro de estado s´olido (NanoDrop 3300) y por microscopia de fluorescencia. El sistema present´o una se?nal cinco veces mayor respecto a los films PET sin poros. Estos resultados preliminares nos permiten pensar en una alternativa simple y directa de inmovilizar prote´ınas para desarrollar sistemas de diagn´ostico como ELISA, arrays de prote´ınas y/o Western Blot.