REARRELO COMPLEJO ASOCIADO A DEFECTOS EN LA REPLICACION DEL ADN POR ?FORK STALLING-TEMPLATE SWITCHING? (FOSTES) COMO CAUSA DE HEMOFILIA A SEVERA SIN INHIBIDOR.

MARTÍN M ABELLEYRO; LILIANA C. ROSSETTI; TOMÁS TETZLAFF; C. PAMELA RADIC; VANINA MARCHIONE; IRENE B. LARRIPA; CARLOS D. DE BRASI

Mar del Plata

Congreso; LX Reunión de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2015

Las grandes deleciones y los rearreglos complejos del F8 son causa de hemofilia A severa (HAs) y predisponen al desarrollo de inhibidores terapéuticos, anti-FVIII. Este trabajo presenta la caracterización molecular completa de un gran rearreglo complejo del F8 (compuesto por la concurrencia de 3 deleciones, 2 inserciones y 1 inversión) detectada por ausencia consistente de amplificación del promotor y el exón 1 del F8 en un paciente con HAs sin inhibidor. Para caracterizar este defecto se estudiaron las regiones 5? y el F8 IVS1 involucradas por un abordaje de análisis de acercamiento por bipartición. Seestudiaron 6 amplímeros río-arriba del F8 (a 100, 50, 25, 12, 6 y 3kb) y 3 amplímeros en el F8 IVS1 (IVS1, IVS1IU, IVS1ID) resultando todos positivos en el paciente hemicigota salvo los amplímeros de 3kb e IVS1ID. La amplificación PCR de larga distancia desde el producto de F8-3,5kb hasta el F8-IVS1 rindió una señal específica del alelo mutado de ≈2kb cuyo análisis de restricción múltiple permitió diseñar primers (F8-3,5kb y F8-IVS1) para la amplificación estándar de la deleción, su caracterización y el diagnóstico molecular directo del paciente, su hermano, madre y hermana. La secuenciación de Sanger del producto de 362bp permitió caracterizar un rearreglo complejo de 23.477bp (ChrX: 154253881-154230138), notación HGSV, NM_000132.3: c.[-3056_143+12716 del 15914 {-3056_-3057 ins GGTCTCG};143+12761_143+14363 del 1602; 143+14363_143+14425 inv;143+14425_143+20543 del 6118{143+14425_143+14426 insCCTGGCTA}]. Este rearreglo del F8 presenta tres deleciones discontinuas, una inversión y dos inserciones (de 7 y 8bp) en sus extremos. Los 4 sitios de ruptura involucrados en la recombinación compleja presentan elementos Alu (AluY, AluS y AluJ). La complejidad estructural de este rearreglo es consistente con el mecanismo FoSTeS(Fork Stalling-Template Switching) por defectos en la replicación del ADN.