Genética de la Hemofilia

DE BRASI CD

CABA

Simposio; Congreso CAHT. Simposio "Aspectos Claves en Hemofilia"; 2012

Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis CAHT

Paradigma de enfermedad hereditaria monogénica recesiva y ligada al cromosoma X, la hemofilia se manifiesta en el varón hemicigota (46,XY) con una prevalencia de 1 en 5000, mientras que la mujer heterocigota (46,XX) (llamada portadora) no suele expresar síntomas de la enfermedad en la inmensa mayoría de los casos. Clínicamente indistinguibles, la hemofilia A (HA) se caracteriza por mutaciones deletéreas en el gen del factor VIII de coagulación (F8, FVIII) y la hemofilia B, por mutaciones en el gen del factor IX (F9, FIX). Los niveles de actividad del factor de coagulación en plasma se correlacionan con la severidad clínica de la hemofilia (desarrollo de artropatías, frecuencia de sangrados espontáneos internos y externos, etc) por lo que la HA y la HB pueden clasificarse en severa con actividad del FVIII:C o FIX:C menor a 1 UI/dl moderada, entre 1 y 5 UI/dl, y leve, entre 5 y 30 UI/dl. A pesar de estas  similitudes, y quizás debido a las diferencias asociadas a la estructura molecular de los genes involucrados y a la heterogeneidad de las mutaciones que los afectan, la HA es 4-5 veces más frecuente que la HB. El F8 tiene 26 exones y abarca 187 kilobases (kb) en Xq28 (Gitschier et al, 1984). El F8 codifica para un RNA mensajero (mRNA) de 9 kb. Entre los intrones del F8 se destaca por su gran tamaño el intrón 22 (32 kb). El mRNA del F8 codifica para un polipéptido de 2351 aminoácidos (aa) incluyendo un péptido señal de 19 aa y un FVIII maduro con una región triplicada de 330 aa (dominios A), una región única de 980 aa (dominio B) y una región duplicada de 150 aa (dominios C) en el orden: NH2.A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2.COOH (a1, a2 y a3 son pequeños dominios acídicos). Localizado en Xq27.1, el F9 presenta ocho exones (A-H) y abarca 33 kb (Yoshitake et al, 1985). El mRNA del F9 (2,8 kb) codifica para una pre-pro-proteína de 27 y 19 aa, respectivamente, y un FIX maduro de 415 aa, compuesto por los dominios NH2.Gla-EGF1-EGF2-pA-Cat.Ser.proteasa.COOH que es activado a FIXa por liberación del péptido (pA) y conformación de una cadena liviana y otra pesada. El clonado y caracterización de los genes del F8 y F9 allanaron el camino para permitir la detección directa de la mutación causal de HA y HB, confinando al análisis indirecto (usando polimorfismos ligados al F8 o F9) a un rol secundario para aplicaciones especiales, más que para los estudios típicos de detección de portadoras en familias con hemofilia. Las mutaciones causales de hemofilia están compiladas y accesibles en Internet: HA-F8 en la página HADB (Hemophilia A Mutation Database: http://hadb.org.uk/), y HB-F9 en la HBMD (Hemophilia B Mutation Database, http://www.kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.html). La mutación más importante en hemofilia es la inversión del intrón 22 del F8 (Inv22) (Lakich et al, 1993) causando el 43% de las HA severas sin distinciones étnicas o geográficas (Antonarakis et al, 1995). También es recurrente la inversión del intrón 1 (Inv1) (Bagnall et al, 2002) causando el 3% de las HA severas. La Inv22 resulta por recombinación no-alélica entre secuencias homólogas de 10 kb (int22h) ubicada una dentro del intrón 22 del F8 (int22h-1) y otra de orientación opuesta, que pertenece a un grupo de dos copias fuera del F8 (int22h-2 e int22h-3) cerca del telómero Xq. La técnica de referencia para estudiar la Inv22 es el Southern blot (Lakich et al, 1993) aunque también se desarrollaron técnicas de análisis rápido: una de ellas basada en PCR de larga distancia (LD-PCR) (Liu et al, 1998) y la otra basada en una modificación del abordaje de PCR inversa (inverse shifting-PCR, IS-PCR) (Rossetti et al, 2005).  En el año 2005, por liberación de la secuencia terminada del cromosoma X humano, se determinó que las copias extragénicas de int22h (i.e., -2 y -3) estaban orientadas inversamente entre sí (cabeza-cabeza) y que sólo una de ellas respecto a int22h-1 podría generar inversiones, mientras que la otra estaría orientada igual a int22h-1 (cabeza-cola) y su recombinación podría generar deleciones (Del22) y duplicaciones (Dup22), pero no inversiones. Aunque no han sido fehacientemente caracterizadas clínicamente, la eventual presencia de la Del22 y la Dup22 podrían causar errores del diagnóstico molecular con los métodos de análisis rápido. Con el objetivo de mejorar el diagnóstico rápido abarcando la detección precisa de estas variantes genómicas hipotéticas, se desarrollaron modificaciones de la técnica de LD-PCR (Bagnall et al, 2006) y de IS-PCR (Rossetti-Radic et al, 2008). El resto de las mutaciones causales de HA y HB en todo el rango se severidad no son recurrentes e incluyen grandes deleciones (por ejemplo las causadas por recombinación homóloga entre secuencias repetidas orientadas igual Alu, Rossetti et al, 2004b), pequeñas Ins o Del (de 1-5 bases) asociadas generalmente a cambios en el marco de lectura o frameshifts, y sustituciones nucleotídicas que predicen defectos tipo missense (cambio de aa), nonsense (aparición de un codón de terminación prematuro) o del splicing del RNA. Para la detección de estas mutaciones pequeñas del F8 y F9 algunos laboratorios utilizan algún abordaje de monitoreo (screening) para evitar la secuenciación directa de todas las regiones importantes del gen correspondiente. De este modo, nuestro laboratorio en Buenos Aires, integra un esquema de 37 y 8 productos PCR para el F8 y F9, respectivamente, que son analizados por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) de alta resolución indicando un segmento que es caracterizado por secuenciación (Rossetti et al, 2007). Una vez determinada la mutación se estudia si el cambio observado es la causa de la hemofilia o si sólo está asociado por contingencia al probando familiar. Este análisis de la relación genotipo-fenotipo en hemofilia se realiza mediante la aplicación de criterios aceptados internacionalmente: (a) el cambio está reportado a en la literatura y/o en las bases de datos correspondientes, (b) en defectos missense,la proteína es alineada con sus ortólogos, los cambios en aa conservados filogenéticamente son más severos que en aquellos no-conservados, (c) el defecto no debe ser observado en al menos 200 cromosomas X de varones sanos de la población general correspondiente, y (d) el defecto es estudiado teóricamente in silico (e.g., en defectos missense se estudian los potenciales cambios la estructura 3D (secundaria/terciaria) de la proteína, y en eventuales defectos de splicing se estudia la eventual destrucción de las secuencias consenso) (Rossetti et al, 2007). Como conclusión, la importancia de la información genética de la mutación causal de la hemofilia en cada familia afectada radica en dos aspectos de la práctica clínica que resultan insoslayables ya transcurrida la primera década del siglo 21, primero, porque constituye la ruta ideal para proveer asesoramiento genético para diagnóstico de portadoras y prenatal, y segundo, porque permite predecir las características y profundidad del fenotipo asociado a cada paciente con un genotipo específico como por ejemplo permite estimar los riesgos a desarrollar inhibidor de la terapia de reemplazo del factor defectuoso.