Caracterización funcional de enzimas vinculadas a la regeneración de NADPH en tripanosomátidos

LEROUX, ALEJANDRO; NOWICKI, CRISTINA

Santa Fé

Congreso; XXIII Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología; 2009

Sociedad Argentina de Protozoología

<!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman"; mso-no-proof:yes;} @page Section1 {size:595.3pt 841.9pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:35.4pt; mso-footer-margin:35.4pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> Los tripanosomátidos (TriTryps) requieren una continua provisión de NADPH para asegurar tanto los procesos de biosíntesis como la defensa frente el estrés oxidativo. Se cree que en la regeneración de NADPH estarían involucradas varias deshidrogenasas tales como las enzimas del ciclo de las pentosas, las enzimas málicas (EMs) y putativas isocitrato deshidrogenasas citosólicas (IDHc), entre otras. Sólo las enzimas de la vía de las pentosas y las EMs de T. cruzi han sido caracterizadas funcionalmente. Con el fin de poder establecer comparaciones entre las distintas vías de regeneración de NADPH activas en los miembros de la familia de TriTryps, nos basamos en la información disponible en los proyectos genoma de estos parásitos para probar la funcionalidad de las putativas EMs de T. brucei y Leishmania. También, investigamos la presencia de la putativa isoforma IDHc en TriTryps. Llamativamente en el genoma de Leishmania se detectó sólo una copia génica y la secuencia de aminoácidos de la putativa IDH se distingue notoriamente de las correspondientes a las IDHcs de tripanosomas. El putativo gen IDH de Leishmania codificaría la isoforma mitocondrial. Para alcanzar los objetivos planteados, clonamos y expresamos las distintas enzimas recombinantes en E. coli. Las EMs de T. brucei caracterizadas en este trabajo presentaron igual distribución subcelular que sus contrapartes en T. cruzi, también sus propiedades cinéticas resultaron semejantes a sus ortólogos en ese patógeno. T. cruzi posee una EM mitocondrial y otra citosólica, siendo esta última marcadamente activada por aspartato (Cannata y col. 1979). De nuestros resultados surge que la isoforma citosólica de T. brucei es 50 veces más sensible a la activación por AcCoA que por aspartato. En cambio, Leishmania posee una EM de localización citosólica que no responde a la activación por aspartato ni por AcCoA y carece de la contraparte mitocondrial. Mediante ensayos de Western-blot pudimos demostrar que las EMs se expresan en los distintos estadios del ciclo de vida de tripanosomas. Por otra parte, comprobamos que tripanosomas, pero no Leishmania sp., poseen IDHcs funcionales, siendo estas isozimas específicas para el NADP. La caracterización cinética de la IDHc de T. cruzi mostró que esta enzima posee Kms aparentes relativamente bajos para el isocitrato (54 uM) y similares a los de las EMs para el NADP (56 uM). A pesar de que las IDHcs de T. cruzi y T. brucei poseen una señal de internalización peroxisomal, estudios de inmunofluorescencia indirecta en procíclicos y extracción con digitonina en epimastigotes confirmaron su localización exclusivamente citosólica. Ensayos de Western-blots mostraron que las IDHcs también se expresan a lo largo de todo el ciclo de vida de ambos tripanosomas. TriTryps cuentan con una variada batería de enzimas capaces de regenerar NADPH. Sin embargo, nuestros resultados muestran que el patrón de expresión de EMs y IDHcs no esta conservado entre estos parásitos, así como tampoco lo están las propiedades bioquímicas de estas enzimas, lo cual pone una vez más en evidencia las diferencias metabólicas entre estos protozoos patógenos. Dado que estos parásitos enfrentan distintas necesidades metabólicas y condiciones particulares de estrés oxidativo a lo largo de sus ciclos de vida, requieren de variadas fuentes de regeneración de NADPH. Es posible que las enzimas que intervienen en estos procesos hayan surgido a partir de la adaptación evolutiva de estos parásitos a los distintos entornos celulares en los cuales se desarrollan.