Estructura y función de una P5-ATPasas de Saccharomyces cerevisiae.

ADAMO HUGO PEDRO; PETROVICH GUIDO DANIEL

Buenos Aires

Simposio; Protein Biophysics at the End of the World v2.0; 2017

Biophysical Society

Estructura y función de una P5-ATPasas deSaccharomyces cerevisiae.La familia de transportadores activos conocidos como  P-ATPasas (P1 a P5) es fundamental para elmantenimiento de la homeostasis celular. Los sustratos transportados porP-ATPasas se restringen hasta el momento a iones y lípidos. P5 es el subgrupomenos estudiado de esta familia, y se presume que transporte un substrato aúndesconocido. La pérdida de función de estas proteínas produce alteraciones endiversas funciones celulares y mutaciones en la P5-ATPasa humana, ATP13A2, hasido asociada con el desarrollo de Enfermedad de Párkinson a temprana edad(Síndrome de Kufor Rakeb).  Con el objetivo de avanzaren el conocimiento de la organización estructural de estas proteínas, se presentaránlos resultados preliminares de experimentos de  proteólisis  parcial de la P5-ATPasa de levadura Spf1. Paraesto usamos una purificación de la P5-ATPasa SPF1 de Saccharomyces cerevisiae y su versión fluorescente GFP-SPF1. SPF1 yGFP-SPF1 fueron expuestos a la acción de Tripsina, Quimotripsina y ProteinasaK. Los fragmentos resultantes fueron analizados por SDS-PAGE seguido de tincióncon Coomassie Blue, medidas de intensidad de fluorescencia, espectrometría demasa  de los fragmentos  y Western Blot.En el congreso realizado en Río de Janeiro el año pasado (LatinAmerican Protein Society Meeting) se mostró la presencia de una región sensiblea proteólisis, ahora al comparar por SDS-PAGE la fragmentación en el tiempo conla fluorescencia de las bandas, se puede observar que la proteólisis comienzadesde esta región cercana al carboxilo terminal hasta el amino terminal contodas las proteasas utilizadas. Por otro lado el ATP, único sustrato conocidode la SPF-1, ejerce un papel protector al exponerla a proteasas, este efecto essuperior en ausencia de Magnesio (en presencia de EDTA). Para finalizar, alproteolizar la SPF-1 en presencia de fosfatidilinositol se estabiliza unfragmento de 100kDa, lo que sugeriría que esta proteína de membrana podríaestar interactuando con fosfoinosítidos.