Sobrexpresión de la P5-ATPasa Spf1/Cod1 en Saccharomyces cerevisiae.

CALVO JAVIER EDUARDO; ADAMO HUGO PEDRO

Quilmes, Buenos Aires

Congreso; XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

Sociedad Argentina se Biofisica

La familia de transportadores de iones conocidos comoP-ATPasas incluyen algunos miembros identificadossobre la base de su secuencia primaria si bien no hansido aun caracterizadas a nivel bioquímico. A las PATPasas del grupo V, hasta la fecha no se les conocenespecificidad iónica de transporte. Distintosestudios muestran que este grupo de enzimas tienenimplicancias en la homeostasis del calcio [1], ladegradación en el sistema HMG CoA reductasa [2] y enhumanos, defectos a nivel de la secuencia codificantehan sido asociadas con un tipo de Parkinsonhereditario [3]. En este trabajo nos proponemossobrexpresar en levaduras la P5-ATPasa SPF1p, obteneruna preparación purificada de la proteína recombinantey avanzar la caracterización bioquímica de la enzimamediante la determinación de la actividad ATPasa, laformación de fosfoenzima y la actividad fosfatasa.La proteína Spf1p fue expresada en Saccharomycescerevisiae a muy bajos niveles. Para sortear esteinconveniente se construyó una variante en la cual laproteína fluorescente verde fue fusionada en elextremo N-terminal de la Spf1p [4]. Esta modificaciónaumentó los niveles de expresión y permitió elseguimiento del proceso de purificación a través demedidas de fluorescencia. Los primeros ensayosrealizados muestran que la proteína recombinantepurificada es capaz de hidrolizar ATP en formadependiente de la concentración de Mg+2.Actualmente se esta llevando a cabo la construcción deuna variante no funcional de la enzima (Spf1p D487N)que nos va a permitir la asociación inequívoca entrela actividad medida y la enzima expresada.Referencias:[1]Cronin SR, Rao R, Hampton RY. J Cell Biol. 2002 Jun10;157(6):1017-28.[2]Cronin SR, Khoury A, Ferry DK, Hampton RY. J CellBiol. 2000 Mar 6;148(5):915-24.[3] Ramirez A, Heimbach A, Gründemann J, Stiller B,Hampshire D, Cid LP, Goebel I, Mubaidin AF, WriekatAL, Roeper J, Al-Din A, Hillmer AM, Karsak M, Liss B,Woods CG, Behrens MI, Kubisch C. Nat Genet. 2006Oct;38(10):1184-91.[4] Corradi GR, Adamo HP. J Biol Chem. 2007 Dec7;282(49):35440-8.Agradecimientos:Los trabajos están siendo llevados adelante mediantesubsidios ANPCyT BID 1728 OC-AR 15-25965, UBACyT B029y CONICET PIP 6168.