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Simposio; Simposio Internacional de la Maestría Internacional en Ciencias Biomédicas de la Universidad de Buenos Aires y de la Universidad Albert Ludwigs de Friburgo (Alemania).; 2008

Institución organizadora:

Universidad de Buenos Aires-Universidad de Friburgo

Resumen:

El transportador de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es fundamental para diversos procesos biológicos. Se distingue de otras P-ATPasas transportadoras de iones por su mecanismo de regulación caracterizado por la existencia de regiones de la molécula que bloquean el sitio catalítico y mantienen a la enzima en un estado basal de muy baja actividad. La calmodulina y los lípidos ácidos actúan como activadores en un proceso fisiológicamente relevante ya que da lugar a una PMCA con capacidad máxima de transporte y una afinidad aparente por Ca2+ un orden de magnitud superior. El mecanismo molecular implicado en la autoinhibición de la PMCA no se conoce aún con detalle, sin embargo, experimentos de transferencia de marca han sugerido que los segmentos 222-ADGILI, 258-SGTHVMEGSGR y 537-CALLGFVT actúan como aceptores del dominio autoinhibitorio. Basados en estos resultados, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante hemos obtenido dos mutantes puntuales: D223A e I227A. Mediante ensayos de western blot se observó que las proteínas mutantes se expresaron correctamente en Saccharomyces cerevisiae y a partir de la membranas microsomales solubilizadas con el detergente C12E10 se obtuvieron las enzimas purificadas mediante cromatografía de afinidad a la calmodulina. La funcionalidad de las mismas se determinó a través de medidas de la capacidad de hidrolizar ATP en un medio de reacción conteniendo 3 mM ATP, 4 mM MgCl2, 100 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7.2), 1 µg de PMCA purificada reconstituida en proteoliposomas de fosfatidilcolina a 37ºC. La mutación D223A provocó la pérdida de actividad Ca2+-ATPasa en tanto que la mutante I227A mostró una Vmax ligeramente menor que la enzima salvaje (2.48 vs. 3.50 umol Pi/ mg prot /min-1). La afinidad aparente por Ca2+ de I227A fue similar a la proteína salvaje tanto en ausencia como en presencia de concentraciones saturantes de calmodulina. Estos resultados indican que el aminoácido D223 cumple un rol esencial en la conservación de la estructura y función de la proteína en tanto que la posición I227 es tolerante a la sustitución por Ala. Agradecimientos: Los trabajos están siendo llevados adelante mediante subsidios ANPCyT BID 1728 OC-AR 15-25965, UBACyt B029 y CONICET PIP 6168