Desplegamiento de una proteína termófila de membrana con cloruro de guanidinio

ERNESTO A. ROMAN; JOSÉ M. ARGÜELLO; F. LUIS GONZÁLEZ-FLECHA

La Plata

Congreso; XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

El plegado y estabilidad son fundamentales para la actividad biologica de las proteínas. Sin embargo, los factores que determinan la estabilidad de las proteínas globulares y sobre todo de las de membrana, no están del todo entendidos. En este trabajo caracterizamos los estados nativo y desplegado de CopA, una proteína termófila de membrana. Los espectros de dicroísmo circulara en el UV lejano de CopA en presencia de 7.5 M GdnHCl son compatibles con una estructura de ovillo al azar. El espectro de fluorescencia intrínseca de CopA posee un centro de masa de 342 nm. En presencia de 7.5 M GdnHCl se corre a 350 nm, siendo este el correspondiente al trp libre en una solución de GdnHCl. Experimentos de apagamiento de fluorescencia con Ioduro de Sodio (NaI) muestran que la proteína nativa tiene una fracción de la fluorescencia intrínseca accesible de 0.48±0.02. Por el contrario, en presencia de 7.5 M de GdnHCl la fracción accesible es de 0.98±0.02. Se analizaron también mezclas de CopA con ácido amino 8 naftaleno sulfónico (ANS) en relación 1:10, en presencia de concentraciones crecientes de GdnHCl. La fluorescencia del ANS desaparece en concentraciones dentre 6 y 7.5 M de GdnHCl. La transición observada ocurre en el mismo rango de concentraciones de desnaturalizante, que el observado en dicroísmo circular y fluorescencia intrínseca. Esto sugiere que el fenómeno observado es el mismo. El ΔG de desplegamiento caculado fue de 3.07±0.67. La variación de este parámetro en el rango de 15 a 70 ºC es muy leve. Por otro lado, tanto la actividad ATPasa como la fosfatasa de CopA disminuye en un rango menor de concentraciones de GdnHCl al observado para las transiciones estructurales. Cuando la enzima es incubada con 6 M GdnHCl y luego diluída a concentraciones menores de desnaturalizante, la actividad se recupera totalmente, en el mismo rango de concentraciones de desnaturalizante. Esto sugiere la presencia de un intermediario inactivo que no observamos con otras técnicas espectroscópicas. Este trabajo se realizó con subsidios de UBA, ANPCyT, y CONICET.