Estabilidad termodinámica de la tiorredoxina de E. coli: aporte de residuos específicos de la hélice C-terminal.

ANA GARROTE; BRUNO MANTA; EDUARDO HOWARD; JOSÉ MARÍA DELFINO; JAVIER SANTOS

La Plata. 5-8 de Diciembre

Congreso; Sociedad Argentina de Biofísica.; 2008

Estabilidad termodinámica de la tiorredoxina de E. coli: aporte de residuos específicos de la hélice a C-terminal  Ana M. Garrote a, b, Bruno Manta c, Eduardo Howardd, José M. Delfinoa y Javier Santosa, b   e-mail: jsantos@qb.ffyb.uba.ar   a Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas. Junín 956, C1113AAD, Ciudad de Buenos Aires, Argentina. b Universidad Nacional de Quilmes. Roque Sáenz Peña 352, B1876BXD,  Bernal , Provincia de Buenos Aires, Argentina. c Institut Pasteur de Montevideo. Calle Mataojo 2020, CP 11400, Montevideo, Uruguay. d Instituto de Física de Líquidos y Sistemas Biológicos. Calle 59-789 CC 565 B1900, La Plata, Argentina.     La tiorredoxina de Escherichia coli (TRX) es una proteína a/b monomérica de 108 residuos. Está involucrada en la catálisis de diversas reacciones redox en la célula. La TRX ha sido extensivamente caracterizada tanto funcional como estructuralmente y es un modelo para el estudio del proceso de plegado. Existe evidencia experimental aportada por nuestro grupo que indica que la hélice C-terminal (Ha5) de la TRX podría tener un rol fundamental en la adquisición de la estructura nativa de esta proteína (1). En este  trabajo se prepararon variantes de TRX con mutaciones puntuales en la región apolar de contacto entre la hélice y el resto de la proteína: L99A, L103A, L107A. También se preparó la mutante puntual E101G, en la que se reemplaza un residuo de la hélice expuesto al solvente. La identidad de las mutantes fue corroborada por secuenciación del DNA y por espectrometría de masa (ESI-MS). El grado de pureza de las proteínas purificadas fue determinada por SDS-PAGE (>98%). Las variantes se caracterizaron espectroscópicamente por fluorescencia y dicroísmo circular (CD). Además se determinó la actividad enzimática específica (reducción de insulina) y el radio hidrodinámico de las mutantes (dispersión luminosa y cromatografía de exclusión molecular, SEC-HPLC). Las variantes fueron caracterizadas termodinámicamente mediante experimentos de desplegado en el equilibrio seguidos por CD (desnaturalización por temperatura) y por fluorescencia (desnaturalización por GuHCl). También se estudió la estabilidad de  las mutantes L99A L103A y de la variante salvaje por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Simultáneamente se realizaron estudios computacionales sobre la estabilidad de las mutantes con el programa FoldX. Los resultados indican que todas las mutantes preparadas presentan un plegado similar al de la proteína salvaje pero con una disminución considerable de su estabilidad (DGºNU). Los reemplazos L99A, L103A y L107A produjeron desestabilizaciones de 2.4, 3.8 y 1.7 kcal·mol‑1. Las mutaciones L99A y L103A parecerían comprometer interacciones terciarias importantes en conjunto con la desestabilización local de la estructura secundaria de la Ha5. Por el contrario, la mutación E101G que introduce libertad conformacional y desestabiliza localmente la estructura secundaria de Ha5, desestabiliza a la TRX en tan sólo 1.0 kcal·mol‑1.   (1) Biochemistry. 2007 May 1; 46(17):5148-59 Con financiamiento de ANPCyT, CONICET, UNQ y UBACyT.