IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
52) Estado ocluido en la Bomba de Ca2+ de membrana plasmática: Optimización del sistema de medida
Autor/es:
M. FERREIRA GOMES; MC DE LA FUENTE; RM. GONZÁLEZ-LEBRERO; RC. ROSSI; JPFC ROSSI
Lugar:
La Plata, Buenos Aires, Argentina
Reunión:
Congreso; XXXVII reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2008
Resumen:
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La
bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es una proteína
transmembrana que acopla el transporte de Ca2+ hacia el medio
extracelular con la hidrólisis de ATP en ADP y ortofosfato inorgánico. Su
funcionamiento es esencial para el mantenimiento de la concentración de Ca2+
intracelular. Su ciclo de reacción involucra la
formación de intermediarios fosforilados y la existencia de transiciones
conformacionales, tanto entre formas fosforiladas (E1P↔E2P)
como desfosforiladas (E1↔E2). Se postula que el Ca2+
se encuentra ocluido en la forma E1P luego de unirse a sitios
citoplasmáticos de la enzima y antes de ser liberado al exterior celular, que
ocurriría luego de la transición E1P®E2P.
El objetivo de este trabajo es identificar y
caracterizar el intermediario en el que el Ca2+ estaría ocluido, E1P(Ca2+).
Un punto clave para el éxito de estos estudios es trabajar con microsomas con
suficiente abundancia en PMCA, lo cual se logró sobreexpresando la enzima en células
Sf9 mediante un sistema de Baculovirus.
Esto produjo un aumento de al menos diez veces en la actividad de la enzima. Un
segundo punto para optimizar las condiciones de trabajo es que, durante las
reacciones, la mayor parte de la enzima se encuentre en el intermediario E1P(Ca2+). Esto se logra agregado LaIII
que bloquea el cambio conformacional E1P®E2P.
Para
saber si la concentración de EP (que en presencia de LaIII se
encontraría mayoritariamente como E1P) es compatible con la cantidad
Ca2+ ocluido en la bomba, se midió EP utilizando [g-32P]ATP,
desnaturalización y precipitación en medio ácido seguido de electroforesis en SDS
y autorradiografía (Echarte y col. Anal. Biochem. 289, 267-273, 2001). La cantidad de EP medida fue cercana a 800
pmol EP/mg PMCA, compatible con resultados de la cantidad de Ca2+ que
presumiblemente se ocluye en la
PMCA, obtenidos en condiciones similares en nuestro
laboratorio.
Experimentos
en los que se midió la cantidad de EP en función de la concentración de PMCA
mostraron un aumento de la cantidad de EP por masa de PMCA a medida que la
concentración de proteína disminuía. Estos resultados concuerdan con otros
obtenidos en nuestro laboratorio (Vanagas y col, Biochim Biophys Acta. 1768(6):1641-9. 2007) en los que la
actividad Ca2+‑ATPasa de la
PMCA aumenta con la disminución de la concentración de la
enzima.
Con
subsidios de ANPCYT, CONICET y UBACYT