Clonado y caracterización de la enzima málica de L. major

LEROUX, ALEJANDRO; NOWICKI, CRISTINA

Chascomús, Prov. Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXII Reunión de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2007

Sociedad Argentina de Protozoología

BBM-32 Clonado y caracterización bioquímica de la enzima málica de Leishmania major. LEROUX A, NOWICKI C. Facultad de Farmacia y Bioquímica - IQUIFIB (UBA-CONICET), Buenos Aires. Argentina. ale.leroux@gmail.com. Las enzimas málicas (EMs) catalizan la decarboxilación oxidativa del malato con la concomitante reducción de NAD(P). En Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei se caracterizaron dos isozimas con diferentes constantes catalícas y modulación alostérica. Estas EMs utilizan sólo NADP como cofactor y se propone que el NADPH producido puede ser aprovechado por los distintos organismos para la defensa contra el stress oxidativo y la síntesis de ácidos grasos. En cambio, el análisis las bases de datos del genoma de Leishmania major utilizando algoritmos tales como el Blast mostó la presencia de un único marco abierto de lectura que codificaría para una putativa EM (CAJ04473). El ADN codificante para esta putativa enzima se amplificó por medio de PCR y se clonó en un vector de expresión, pET 28. La  funcionalidad esta enzima se enzayó por medio de la expresión heteróloga en Escherichia coli. Se comprobó que la EM de L. major  sólo utiliza NADP como cofactor y no NAD. La caracterización cinética mostró un Km aparente de 0,437 mM para el malato y 0,039 mM para el NADP, mientras que la afinidad de la enzima por piruvato fue mucho menor.Esta enzima de es insensible a la modulación alostérica por aspartato, por lo tanto, y a diferencia de los tripanosomas, L. major carecería de la EM activada por aspartato.