Caracterizacion estructural del desplegamiento de una prote¨ªna term¨®fila de membrana

ERNESTO A. ROMAN, JOSE M. ARGUELLO,F. LUIS GONZALEZ FLECHA

Universidad Nacional de Quilmes, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

Workshop; Workshop de la Sociedad Argentina de Biofisica; 2007

Sociedad Argentina de Biofisica

El plegado y estabilidad son fundamentales para la actividad biol¨®gica de las prote¨ªnas. Sin embargo, los factores que influyen en la estabilidad no est¨¢n del todo entendidos. CopA es una P-ATPasa term¨®fila de Archaeoglobus fulgidus. En comunicaciones previas mostramos que en presencia de Cloruro de Guanidinio (GndHCl) y Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) la fluorescencia de tr¨ªptofanos (Trp) disminuye reversiblemente. La [¦È]222nm disminuye en presencia de GndHCl de manera reversible mientras que con SDS la [¦È]222nm no se modifica apreciablemente. CopA se inactiva totalmente, en forma reversible, en presencia de GndHCl y SDS, en este ¨²ltimo caso, en concentraciones menores a la CMC. El objetivo de este trabajo es estudiar c¨®mo transcurre la desnaturalizaci¨®n qu¨ªmica de CopA y evaluar c¨®mo cambia la estructura global de esta prote¨ªna. CopA fue expresada en forma heter¨®loga en E. coli, solubilizada en dodecilmalt¨®sido,  purificada por afinidad, y reconstitu¨ªda en micelas de l¨ªpidos-detergente. La enzima purificada retuvo un m¨¢ximo de actividad ATPasa a 75 grados. Los efectos del GndHCl los estudiamos a trav¨¦s de experimentos de quenching de Trp por Ioduro de Sodio. Nuestros resultados muestran que en ausencia del desnaturalizante hay una fracci¨®n de Trp expuestos al solvente de 0,36 mientras que en presencia de GndHCl 6 M la fracci¨®n accesible  aumenta a un valor de 0,86. Los efectos del SDS  los evaluamos a trav¨¦s de geles de SDS-PAGE, y midiendo cambios en el radio hidrodin¨¢mico por dispersi¨®n de luz. Resultados preliminares indican que el SDS induce una expansi¨®n en la prote¨ªna que se refleja en un aumento del radio hidrodin¨¢mico. El trabajo en su conjunto muestra un proceso de desnaturalizaci¨®n reversible con estados desplegados diferentes para cada desnaturalizante. El  GndHCl lleva a un estado final de gl¨®bulo fundido mientras que en presencia de SDS el estado final parece ser una estructura expandida con persistencia de estructura secundaria. Experimentos de dispersi¨®n de luz permitir¨¢n evaluar cambios de volumen en CopA. Por otro lado, disponemos de mutantes puntuales de ciste¨ªnas tanto en las regiones solubles como en las transmembranicas, las cuales nos permitir¨¢n estudiar cambios en regiones puntuales de CopA.