Desnaturalización de la Bomba de Calcio de la Membrana Plasmática mediante el Congelamiento.

IONA P GARBER COHEN; PABLO R CASTELLO; F LUIS GONZÁLEZ FLECHA

Bernal, Buenos Aires

Congreso; Taller de la Sociedad Argentina de Biofísica. Biofísica de macromoléculas: aspectos estructurales e implicancias biológicas y biotecnológicas; 2007

Sociedad Argentina de Biofísica

Desnaturalización de la Bomba de Calcio de la Membrana Plasmática mediante el Congelamiento Iona P Garber Cohen1, Pablo R Castello2 y F Luis González Flecha1 1Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica – Facultad de Farmacia y Bioquímica - Universidad de Buenos Aires CONICET, Junín 956 Buenos Aires Argentina. 2Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, Colorado 80309, USA. ionagarber@hotmail.com La bomba de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA) es una proteína integral cuya función es la de transportar activamente Ca2+ hacia el medio extracelular. En comunicaciones anteriores hemos demostrado que la actividad enzimática disminuye exponencialmente con el número de ciclos de congelamiento-descongelamiento (C-D). Esta inactivación depende de la velocidad de enfriamiento, siendo de elección para conservar las propiedades funcionales el enfriamiento a 4 K.s-1. Mediante este proceso la PMCA no sufre agregación ni ruptura aparente de la cadena polipeptídica, mientras que la fluorescencia intrínseca disminuye con el número de ciclos. En el presente trabajo analizamos el comportamiento de distintos parámetros estructurales durante la inactivación de la PMCA producida por congelamiento. Mediante SDS-PAGE observamos una única banda de peso molecular 134000 tanto en la proteína nativa como en la inactivada por ciclos C-D enfriando a 4 y a 0,03 Ks-1, y por incubación durante 48 hs a -20ºC. En geles nativos se observaron en todos los casos,  dos únicas bandas correspondiendo al dímero y monómero de la PMCA. Por otra parte, los espectros de dicroísmo circular de la PMCA muestran una disminución de la elipticidad a 222 nm luego de realizarle ciclos de C-D enfriando a 4 K.s-1. La fluorescencia intrínseca de la PMCA disminuyó en función del número de ciclos y encontramos una dependencia exponencial de la intensidad de fluorescencia con el número de ciclos para ambas velocidades de enfriamiento ensayadas: El valor de n½ que proporcionó el mejor ajuste fue de 9,5 ± 0,7 en el caso del enfriamiento 4 K.s-1 y de 4,7 ± 0,2 en el enfriamiento a 0,03 Ks-1, valores comparables a los obtenidos para la inactivación. Adicionalmente, experimentos de quenching con arcrilamida demostraron en la PMCA inactivada por congelamiento una mayor exposición de los triptofanos al quencher respecto de la nativa. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la pérdida de actividad producida por el congelamiento está acompañada por pequeños cambios estructurales. Esto sugiere que la inactivación es resultado de la desnaturalización parcial e irreversible de la proteína. Este trabajo fue realizado con subsidios de UBA, CONICET y ANPCyT