IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
¨Caracterización cinética de un posible intermediario de transporte de Ca2+ en la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática expresada en un sistema de Baculovirus¨.
Autor/es:
FERREIRA GOMES MARIELA; CANDELARIA DE LA FUENTE; GONZALEZ LEBRERO, RODOLFO; ROSSI, R.C.; ROSSI, J.P.F.C.
Lugar:
MAR DEL PLATA
Reunión:
Congreso; LII Annual Scientific Meeting. Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2007
Institución organizadora:
SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACION CLINICA
Resumen:
Kinetic characterization of a possible Ca2+
transport intermediate in the plasma membrane Ca2+-ATPase
Ferreira Gomes, Mariela; de la Fuente, María C;
González-Lebrero, Rodolfo M.; Rossi, Rolando C.; Rossi Juan Pablo F. C.
IQUIFIB-Departamento de
Química Biológica, FFyB,UBA. Junín 956 (1113) Buenos
Aires.
The Plasma Membrane Calcium
ATPase (PMCA) is a calmodulin-regulated P-type ATPase responsible for the
maintenance of low intracellular concentrations of Ca2+ in most
eukaryotic cells. It couples the transport of Ca2+ out of the cells
with the hydrolysis of ATP into ADP and inorganic phosphate. The current kinetic
model proposes that the enzyme exists in two main conformations, E1
and E2. After binding of intracellular Ca2+ to
high-affinity sites, E1 can be phosphorylated by ATP with formation
of the intermediate E1P, which would result in occlusion of bound Ca2+.
After a conformational transition to E2P, Ca2+ would be
released to the extracellular medium from low-affinity sites, the phosphoenzyme
is hydrolyzed and the resulting E2 intermediate state undergoes a
new conformational transition to E1.
We have developed a procedure
to measure Ca2+-occlusion in microsomal preparations of PMCA. PMCA
was produced by Baculovirusmediated expression in Sf9 insect cells and
isolated as microsomal membranes. As we reported earlier (de la Fuente et al., 2005), we
have detected occlusion of Ca2+ ions in this microsomal preparation
of PMCA using the method of Rossi et al. which combines a quench-flow apparatus
with a rapid-filtration device with a time resolution of 3.5 ms.
Tight binding of Ca2+
was measured as a function of time in media containing different amounts of a
microsomal preparation of PMCA (50-100 mg/ml), 100 mM (45Ca)Ca2+,
in the presence or absence of 3
mM Mg2+, and with or without 50 mM LaIII.
LaIII decrease the speed of conformational change E1P → E2P,
producing an accumulation of E1P, state in which Ca2+ would occlude.
The experiments were performed with or without (control) 2 mM ATP.
Results show that the binding
of Ca2+ can be described by the sum of two increasing exponential
functions of time with of approximately the same size and apparent rate
constants of about 0,1 and 0,006 sec-1. The levels of Ca2+
binding in the presence of 3 mM
Mg2+ are fivefold greater than in the absence of this ion. Thermal
inactivation of the microsomal preparation of PMCA decreased the Ca2+
binding to a minimum.
Hemos medido la unión fuerte de
Ca2+ en función de tiempo en medios que contenían una preparación
microsomal de PMCA (50-100 g/ml) en presencia de 100mM (45Ca) Ca2+, y en presencia o ausencia
de 3 mM
Mg2+, y con o sin 50
mM LaIII..
El LaIII disminuye la velocidad del cambio conformacional entre E2P→E1P,
produciendo una acumulación de E1P, estado en el cual el Ca2+
se ocluiría. Los resultados muestran que la unión de Ca2+ puede
describirse por la suma de dos funciones exponenciales con aproximadamente el
mismo tamaño y con constantes aparentes de velocidad entre 0.1 y 0.006 sec-1
respectivamente. Los niveles de Ca2+ unidos en presencia de 3 mM Mg2+ son cinco
veces mayores que en ausencia de este ión. La inactivación térmica de la
preparación microsomal de PMCA disminuye hasta cero la unión de Ca2+
Este fenómeno es estrictamente dependiente de ATP en ausencia de LaIII
pero en presencia de este bloqueante del paso E2P→E1P se
hace independiente del nucleótido. Estos resultados son similares a los que
hemos obtenido en experimentos de fosforilación en estado preestacionario y
estacionario utilizando la isoforma PMCA4.