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La bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) se encuentra en todas las células eucariotas. Transporta calcio contra el gradiente electroquímico desde el citoplasma hacia el exterior celular, acoplado a la hidrólisis de ATP. Pertenece a la familia de las P-ATPasas cuyo ciclo de reacciones es descripto por un modelo de dos conformaciones extremas E1-E2. El Ca2+ se une llevando a la enzima a la conformación E1. La unión de ATP y la consiguiente autofosforilación llevan a E1P. Con un nuevo cambio conformacional se alcanza E2P, que permite liberar el calcio del lado opuesto de la membrana. Luego se produce la hidrólisis del fosfato liberando a la enzima en su conformación E2, completándose el ciclo de reacción. La molécula de ATP a partir de la cual se produce la fosforilación se une con alta afinidad (Km1 = 10-17 M). Sin embargo, se ha descripto la presencia de un sitio de unión a ATP regulatorio, asociado a las conformaciones E2 y de menor afinidad (Km2 = 200-400 M) que aumentaría la velocidad del transporte de Ca2+. El objetivo de este trabajo fue estudiar la unión del ATP a la PMCA y los cambios conformacionales asociados al dominio de unión al nucleótido, mediante la utilización del análogo fluorescente TNP-ATP. Esta sonda fue utilizada para estudiar transportadores tipo casette ABC y la bomba de calcio de retículo sarcoplasmático, sin embargo, nunca ha sido aplicada al estudio de la PMCA. La PMCA utilizada es una preparación aislada de membranas de eritrocitos humanos purificada con una columna de afinidad de calmodulina. Nuestros resultados muestran que (1) El TNP-ATP interacciona con la PMCA, aumentado significativamente su rendimiento cuántico debido al cambio en la hidrofobicidad del entorno. (2) En E1 la afinidad de la PMCA por TNP-ATP es 10 veces mayor que en E2 (3) El rendimiento cuántico de la sonda es mayor en E1 que en E2P, sugiriendo que el dominio de unión a ATP se encuentra más expuesto en esta última conformación (4). Sorprendentemente, la afinidad por TNP-ATP de la PMCA fue similar en E1 y E2P, indicando que el ATP podría unirse con alta afinidad a E2P. Este trabajo establece las bases para el estudio exhaustivo del ciclo de reacciones de la PMCA en el que se planea utilizar otras sondas fluorescentes para determinar los cambios conformacionales de las P-ATPasas de membrana.