Consecuencias funcionales del procesamiento alternativo en el sitio “A” del transportador de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA)

GERARDO R. CORRADI; LUCIANA R. MAZZITELLI; ROCHI LUCIA; DE TEZANOS PINTO FELICITAS; HUGO P. ADAMO

Congreso; XL SAB 2011; 2011

SAB

El transportador de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) pertenece a la familia P2B de ATPasas transportadoras de iones. La interacción directa de la CaM con el dominio C-terminal de la PMCA o la activación por lípidos ácidos, causan un aumento tanto en la Vmax como en la afinidad aparente por Ca2+ de la enzima. Existen 4 genes que codifican para distintas isoformas de la proteína (1-4) cada una de las cuales está sujeta a procesamiento alternativo en dos sitios (A y C)1. La isoforma más abundante y ubicua es la PMCA4. El procesamiento alternativo en el sitio A de esta isoforma, genera dos variantes x y z que difieren solamente en la inclusión o no (respectivamente) de los aminoácidos 301-312. En el presente trabajo, se expresaron las isoformas h4x y h4z fusionadas a la proteína fluorescente verde (GFP)2 en S. cerevisiae y a partir de membranas microsomales solubilizadas con el detergente C12E10 se obtuvo la enzima purificada mediante cromatografía de afinidad por CaM. En ausencia de activadores la isoforma h4z exhibió una afinidad aparente por Ca2+ ligeramente superior a la isoforma h4x (1.00 ± 0.04 y 1.26 ± 0.08 µM respectivamente) y una Vmax 50% mayor que la isoforma h4x sugiriendo que la variante h4z se halla parcialmente activada. El agregado de calmodulina aumentó la Vmax (Vmax (h4z) 4.06 ± 0.17 y Vmax (h4x) 2.34 ± 0.07 µmol Pi/mg prot/min) y disminuyó el K0.5 para Ca2+ de ambas enzimas hasta valores similares (K0.5 (h4z) 0.52 ± 0.04 y K0.5 (h4x)  0.50 ± 0.03 µM). Asimismo, la expresión de la isoforma h4z permitió el rescate fenotípico de la cepa K616 en un medio deficiente de Ca2+. Los resultados obtenidos muestran que la deleción de los residuos 301-312 da lugar a una enzima (h4z) que en su estado basal, tanto in vitro como in vivo, se encuentra parcialmente activada pero conserva la capacidad de ser activada por calmodulina.