Anticuerpos específicos de dominio único, buenos candidatos para el desarrollo de inmunoensayos en condiciones desnaturalizantes

ALZOGARAY V; DOÑA V; CHIRDO F; GOLDBAUM F; URRUTIA M

Mar del Plata

Congreso; LVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2009

Sociedad Argentina de Inmunologia

Cantidades residuales de agentes reductores y/o desnaturalizantes utilizados en el proceso de extracción de analitos suelen interferir con la determinación cuantitativa en los inmunoensayos. Así ocurre en la certificación de alimentos para celíacos, quienes necesitan una dieta libre de gliadinas (proteínas de trigo). Los camélidos (camellos, dromedarios, llamas) producen anticuerpos (acs) inusuales compuestos solo de cadenas pesadas, siendo su sitio de unión al antígeno solo la región variable de la cadena pesada (VHHs). Dada la alta estabilidad de lso VHHs, el objetivo de este trabajo fue la generación de una biblioteca de fragmentos VHH y la selección de clones reactivos en condiciones desnaturalizantes. Partiendo del cDNA aislado de linfocitos de sangre periférica de llamas inmunizadas con gliadinas (GD) se generó una biblioteca de fragmentos VHHs con alta diversidad, conteniendo 8x107 clones. El panning y la selección de la biblioteca se realizó mediante la técnica de display en fagos. Ensayos de unión por ELISA nos permitieron aislar clones con capacidad de unirse a GD. La estabilidad de estos clones se evaluó por ELISA indirecto incubándolos en presencia de etanol (Et), 2-mercaptoetanol (2ME), cloruro de guanidinio (G). Cuatro clones fueron estables en Et 15% y mostraron más de un 50% de reactividad en presencia de 0.5% 2ME y 0.5 mM G. El clon 26, tuvo capacidad de reconocer al antígeno aún en presencia de Et 15%, 2ME 0.5%, G 0,5M. Los cuatro VHHs seleccionados mostraron secuencias muy similares con CDR3s largos y dos cysteínas (cys) extras en el CDR3, separados por solo 4 residuos. Estas cys forman un puente disulfuro, disminuyendo la flexibilidad del loop, contribuyendo así a la estabilidad de estos VHHs. Se mencionaran otros VHHs altamente estables en otras condiciones desnaturalizantes. Los resultados indican que los VHH a diferencia de los acs convencionales son buenos candidatos para el reconocimiento de antígenos en condiciones desnaturalizantes.