USO DE UN CONTROL DE AMPLIFICACION INTERNO EN LA DETECCION DE Escherichia coli PRODUCTOR DE TOXINA SHIGA POR PCR MULTIPLE, EN HECES DE ORIGEN PEDIATRICO

SALINAS AG; ZARATE JM; CHIALVA C; JURI AYUB M; LUCERO ESTRADA C; CHINEN I; ESCUDERO ME

Buenos Aires

Congreso; XII CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGÍA; 2010

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un reconocido enteropatógeno que causa colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico en la población infantil de nuestro país. El empleo de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la detección de este microorganismo directamente en materia fecal de los pacientes presenta la ventaja, sobre las técnicas de cultivo, de acortar los tiempos de diagnóstico permitiendo adoptar medidas terapéuticas y epidemiológicas más efectivas. Por la naturaleza de la muestra, se corre el riesgo de obtener falsos resultados negativos debido a inhibición de la PCR. El uso de un control de amplificación interno (CAI) resulta útil para diferenciar entre resultados negativos verdaderos y falsos. El CAI es una secuencia de ácido nucleico adicionada a la mezcla de reacción para PCR con el objeto de ser co-amplificada en el mismo tubo por el par de cebadores dirigidos a la secuencia de ADN blanco y que se distingue de ésta por una diferencia en el tamaño molecular detectable por electroforesis en gel de agarosa. Un resultado positivo para CAI indica que la reacción de amplificación ha ocurrido satisfactoriamente.   En este trabajo se propuso la detección de  Escherichia coli  productor de toxina Shiga (STEC) directamente en materia fecal humana mediante el protocolo de PCR múltiple (PCRm) para los genes stx1, stx2 y rfbO157, diseñado en el Servicio Fisiopatogenia de INEI-ANLIS (Buenos Aires, Argentina),  utilizando un CAI de 280 pb, correspondiente a una deleción interna de la secuencia stx2 original, de 349 pb, y flanqueada por el mismo par de cebadores. Se contaminó 1 g de materia fecal de niño sano con 109, 107 y 105 ufc/ml de la cepa local E. coli O157:H7 stx2+ aislada de un paciente pediátrico con síndrome urémico hemolítico (SUH), en 9 ml de caldo EC. Se realizó extracción de ADN por el método de “boiling”, y se preparó la mezcla de reacción incorporando CAI en concentración 1,5 ng/ml. El mismo protocolo fue aplicado en materia fecal no contaminada, y en distintas diluciones de las cepas local y de referencia E. coli O157:H7 EDL 933 stx1+/stx2+. El límite de detección de E. coli O157:H7 fue de 107 ufc/g en heces y de 103 ufc/ml en las cepas puras. En todos los casos se observó amplificación de CAI confirmando la buena performance de la técnica y la ausencia de inhibidores.  Conclusiones La detección de E. coli STEC se puede realizar por PCRm, directamente en materia fecal de paciente pediátrico, en un tiempo no mayor a 4.5 h, utilizando CAI en reacción competitiva con el ADN blanco para evitar el riesgo de informar falsos resultados negativos.