Los receptores a Manosa-6-fosfato podrían estar involucrados en la secreción de algunas enzimas lisosomales en epidídimo de rata

BANNOUD N; AGUILERA C; BARRERA PE; SOSA MA; CARVELLI L

Mendoza

Jornada; Jornadas Virtuales de investigación de la Facultad de Ciencias Médicas; 2008

Facultad de Ciencias Médicas UNCuyo

LOS RECEPTORES A MANOSA-6-FOSFATO PODRÍAN ESTAR INVOLUCRADOS EN LA SECRECIÓN DE ALGUNAS ENZIMAS LISOSOMALES EN EPIDIDIMO DE RATA. Bannoud N, Aguilera C, Barrera EP, Sosa MA, Carvelli L. IHEM-CONICET, Fac. Cs. Médicas, UNCuyo, Mendoza, Argentina El epidídimo de los mamíferos almacena espermatozoides y participa en el proceso de maduración de los mismos. La integridad y funcionalidad de este órgano dependen de la acción de hormonas esteroidales, ya que la castración quirúrgica induce involución del epidídimo en pocos días. El epitelio epididimario secreta al lumen numerosas proteínas que podrían participar de diversas maneras en la maduración espermática. A su vez, esta secreción está enriquecida en hidrolasas ácidas, un hecho llamativo si se tiene en cuenta que en la mayoría de los tipos celulares estas enzimas están confinadas a los lisosomas. Algunos trabajos previos han demostrado que la secreción de algunas enzimas es regulada por hormonas androgénicas. En células de mamíferos la normal distribución de enzimas a lisosomas es regulada por receptores a manosa-6-fosfato (MPRs) que reconocen un residuo de manosa fosforilada sobre las moléculas enzimáticas. Dos formas de estos receptores han sido descriptas hasta el momento; el catión-dependiente (CD-MPR) y el catión-independiente (CI-MPR) y ambos co-existen en la mayoría de los tipos celulares.  No se conoce hasta el momento si estos receptores son redundantes o si reconocen lotes diferentes de enzimas.  Además de transportar enzimas a lisosomas el CI-MPR podría cumplir otras funciones ya que también reconoce otros ligandos desprovistos de manosa-6-fosfato,  como por ejemplo algunos factores de crecimiento (IGF-II o b-TGF). Además, el CI-MPR puede ser localizado en la membrana plasmática para recapturar enzimas que han escapado al medio extracelular.  El CD-MPR, en cambio, no ha sido asociado con  procesos endocíticos, pero se le ha atribuido una posible función en procesos exocíticos.  A partir de estos conocimientos previos nos preguntamos si los MPRs tienen alguna incidencia en la secreción de enzimas lisosomales y si a su vez, los cambios en la acción de hormonas esteroidales inducen alteraciones en la localización y en los niveles de expresión de estos receptores.   Metodología: En este trabajo evaluamos la expresión y distribución de ambos MPRs en epidídimos de animales controles o castrados quirúrgicamente.  Ratas Sprague-Dawley adultas (90 días de edad) fueron separadas en dos grupos, el primero fue utilizado como control y al segundo se le realizó orquidectomía por vía abdominal. Los animales de ambos grupos fueron sacrificados a las 48 horas después de la castración. Sus epidídimos fueron removidos y las caudas retroperfundidas, con buffer isotónico.  Luego de separar el contenido del lúmen (espermatozoides y fluido) el tejido fue homogeneizado para obtener una fracción membranosa y una soluble.  La expresión de los MPRs fue estudiada desde la fracción membranosa por Western blot usando los anticuerpos correspondientes. Alternativamente, los MPRs fueron cuantificados por ensayos “binding” de b-glucuronidasa exógena a membranas de epidídimo. Las actividades de las enzimas b-galactosidasa (GAL), N-acetil-b-D-glucosaminidasa (NAG) y a-manosidasa (MAN) fueron determinadas desde los fluidos por espectrofluorometría. La presencia de catepsina D fue evaluada por Western blot. Para estudiar la localización de los MPRs se hicieron fraccionamientos de tejido en gradientes de Percoll y los receptores fueron detectados desde cada fracción por Western blot.  Resultados: Observamos que la expresión de ambos MPRs se incrementó en  la cauda epididimaria de los animales castrados, siendo el efecto más significativo para el CD-MPR (Figura 1). Estos datos fueron corroborados por los ensayos de “binding” de b-glucuronidasa. (Figura 2). Por RT-PCR se comprobó que la regulación podría ser post-transcripcional (datos no mostrados). De las cuatro enzimas estudiadas, a-MAN y catepsina D,  fueron incrementadas en los fluidos de los animales castrados (Figura 3), en correspondencia con su afinidad por los MPRs.  El aumento en la expresión de MPRs no fue debido a la injuria ocasionada por la castración, ya que la droga antiandrogénica Flutamida produjo similar efecto (Figura 4). Interesantemente, parte del CD-MPR de los animales castrados se relocalizó en zonas más livianas del gradiente de Percoll, indicando una posible redistribución a la membrana plasmática (Figura 5). Con estos resultados concluimos que los MPRs podrían ser regulados por cambios hormonales en el tejido epididimario, y que probablemente CD-MPR sea el responsable del transporte y secreción de algunas enzimas lisosomales en el órgano.