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LOS EFECTOS HIPERTROFICOS Y FIBROTICOS DE LA ANGIOTENSINAII (AII) SON MEDIADOS POR TRH (HORMONA LIBERADORA DE TIROTROFINA) EN EL RATONCON INFUSION DE AII: CONFIRMACION ?IN VITRO?.PERESDIAZ LS; SCHUMAN ML; AISICOVICH M, TOBLLI J; LANDA MS; GARCIA SI. CARDIOLOGIA MOLECULAR, INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MÉDICAS A LANARI, FAC.DE MEDICINA,UBA; IDIM-CONICET.Hemos demostradosque el sistema de la TRH cardiaco participa en el desarrollo de hipertrofiacardiaca (HC) en ratas SHR y que su inhibición previene la (HC) apesar de la severa hipertensión presentesugiriendo la participación del tripeptido en este proceso (Schuman 2011). Más aún, observamos que la sobreexpresión de TRH en elVI, provocada por inyección intracardiaca de un plásmido que sobreexpresa TRH,induce el fenotipo del corazón hipertrofiado en una rata Wistar normalinduciendo la expresión de marcadores de hipertrofia y fibrosis (Schuman 2014). Esconocido que la angiotensina II (AII) además de vasopresora es proinflamatoriae induce hipertrofia y fibrosis cardíaca en diferentes modelos animales. Enbase a estos antecedentes hipotetizamos que la TRH cardíaca podría mediar losefectos hipertróficos y fibróticos de la AII en el miocardio. Con este objetivode estudio utilizamos ratones C57 adultos a los que se les realizó una infusión continua de AII (bomba osmotica 2mg/kg/día) vs. Fisiológica (SF) durante 7d, y evaluamos los daños en dosgrupos, uno al que previamente se le inhibió el sistema de TRH a través de unainyección intracardíaca de un siRNA específico contra el precursor de TRH(siRNA-TRH) vs uno con el sistema de TRH cardíaco intacto (siRNA-Con).Registramos diariamente el peso corporal, la presión arterial sistólica (PAS) yel consumo de agua. Al sacrificio, se extrajo el corazón y se midió T3 y T4. Apartir del RNA total de ventrículo izquierdo (VI) se cuantificó la expresióndel mRNA de preTRH, su receptor (r-TRH I), colágeno III, BMHC, BNP y TGF-B porPCR en tiempo real. Observamos que la AIIaumentó (p< 0.05) la PAS en ambos grupos evidenciando su efectividad,además provocó un aumento (p< 0.05) de la expresión de TRH cardíacasólo en el grupo AII+siRNA-Con, verificándose la inducción de TRH por AII y tambiénla efectividad del bloqueo del sistema mediante siRNA-TRH. No hubo cambios enel índice hipertrófico (peso corazón/peso corporal) probablemente debido a lacorta duración del experimento; aún así, a los 7d, la AII fue capaz de inducirel aumento (p<0.05) en la expresiónde BNP, BMHC, colágeno III y TGF-B en el grupo AII+siRNA-Con, aumento que no seobservó en el grupo con el sistema de la TRH cardiaco bloqueado, grupo quepresentó una expresión de los marcadores de daño cardíaco similar a losanimales con SF sugiriendo que a los 7 dias de infusión, el proceso de hipertrofiacardiaca estaba recién comenzando y la TRH cardíaca participaba en los efectosinducidos por AII.Entendiendoque en este protocolo la ausencia de cambios en el índice de hipertrofia podríadeberse a la corta duración del tratamiento, decidimos repetir el mismoprotocolo extendiendo el tiempo de infusión de AII al doble del tiempo (14 d),para evidenciar el aumento de hipertrofia a través del índice e investigar sila ausencia de TRH cardíaca podría atenuarlo.Observamosque la AII aumentó (p< 0.05) provocó un aumento (p< 0.05) de la expresión de TRH cardíaca sólo en el grupoAII+siRNA-Con, verificándose la inducción de TRH por AII observada a los 7 días.Pudimos confirmar este resultado a nivel proteico mediante inmunohistoquimica(p<0.01) observando una marcada coloración en el grupo AII+siRNA-Con que sevio atenuada en el grupo con el sistema de la TRH cardiaco inhibido y fue casiindetectable en los grupos con SF.Como eraesperable, la AII nuevamente indujo un aumento (p<0.05) de la PAS y a favor denuestra hipótesis, encontramos un aumento del índice hipertrófico sólo en el grupotratado con AII+siRNA-Con, mientras que los animales sometidos a la infusión deAII con el sistema de la TRH bloqueado mostraron un índice hipertrófico similaral grupo con SF (p<0.05) indicando que el bloqueo de TRH atenúa los efectosde AII.A favorde este resultado observamos que, AII indujo un aumento (p<0.05) de laexpresión del mRNA de BNPy BMHC, en el grupo AII+siRNA-Con, aumento queno se observó en el grupo AII+siRNA-TRH sugiriendo que la TRH estaríaparticipando en la hipertrofia inducida porAII.Enconcordancia observamos la inducción (p<0.05) de la expresión del gen deTGFb por parte de la AII que se vio atenuada al inhibir el sistema TRH. Esteresultado fue confirmado a nivel proteico por inmunohistoquimica en donde seobserva que la proteína es casi indetectable en los grupos controles, con unainducción de 6 veces con AII que cae a un tercio en el grupo con AII y elsistema de TRH bloqueado (p<0.01). A favor de que TGFB es un factor clave enla inducción de fibrosis mediada por AII, observamos que el octapéptido indujoun aumento (p<0.05) de la expresión del mRNA de colágeno III en elgrupo AII+siRNA-Con, aumento que no se observó en el grupo AII+siRNA-TRH, esteresultado es coincidente con la tinción de Sirius red y de Tricromico de mason en las cuales sepudo observar que hay una intensa coloración (roja y azul respectivamente) enel grupo tratado con AII con el sistema TRH intacto mientras que el grupo conel sistema inhibido la señal disminuyó (p<0.01) al 50 % aproximadamente evidenciando la participación del tripeptidoen el proceso fibrotico inducido por AII. Tratandode dilucidar si la acción de AII sobre TRH se daba en forma directa es que utilizamosel cultivo de células y teniendo en cuenta que el fibroblasto posee el sistema de TRH y es responsables de la fibrosis a través de laexpresión de colágenos y la consecuente expansión de la MEC, crucial en esta patología utilizamos la línea celular de fibroblastos de ratón NIH3T3. En este ensayo, estimulamos loscultivos por 24h con AII (1uM) ( n=7 por grupo) a los que previamenteles inhibimos el sistema de TRH, mediante la transfeccion de un siRNA especifico contra el precursor de TRH(siRNA-TRH), comparándolos con células con el sistema de TRH intacto(siRNA-Con). La transfección se realizó 36 hs previo al estimulo utilizandolipofectamina 2000. A las 24 hs post estímulo con AII, los cultivos fueronlevantados y a partir del RNA total se cuantificó la expresión del mRNA depreTRH, colágeno III, colágeno I, TGF-B y BNP por PCR en tiempo real. A favorde nuestra hipótesis, observamos que la AII aumentó (p<0.03) la expresión deTRH. Este aumento solo se evidenció en el grupo de AII+siRNA-Con con el sistemade TRH activo confirmando además que la maniobra del bloqueo fue efectiva. Laacción de AII sólo indujo la expresión de colágeno III, TGF-B y BNP en el grupo que presentó aumento de TRH demostrando que en necesarioel sistema de TRH en los efectos de laAII. Por último, decidimos estudiar si la inducción de TRH vía AII involucrabaal receptor AT1 y para evaluarlo bloqueamos el receptor AT1 con un antagonistaespecífico (losartan 10 uM) durante 3 hs antes del agregado de AII en dosis de 1 y 10 uM durante 24 hs enmedio libre de suero definiendo 6 grupos (n=7): 1=Agua, 2=AII 1uM, 3=AII 10 uM,4=agua+losartan, 5=AII 1uM+lossartan, 6=AII10uM+losartan. Como esperábamos, laAII indujo un aumento de TGF-B (p<0.01), aumento que fue completamente bloqueadocon el agregado de losartan (p< 0.01) evidenciando la efectividad deltratamiento y la de su bloqueante. Al evaluar la expresión de TRH observamos unmarcado aumento en el grupo estimulado con AII 10 uM que se vió atenuadosignificativamente con el agregado previo de losartan. Asi podemos proponer quela TRH podría actuar como mediador de los efectos fibróticos de la AII inducidos a través de su receptor AT1. Entendiendo que en el corazón los fibroblastosinteractúan con los miocitos eintercambian señales que luego integran el tejido cardiaco en su conjunto,abordamos también el estudio en cultivo celular de la línea H9C2 (miocitos derata) en la que primeramente quisimos evaluar el efecto del estimulo con AIIsobre la expresión de TRH. Repitiendo el modelo de estimulación con AII y elbloqueo de TRH por transfección del siRNA mediante lipofectamina, observamosque la acción de AII sólo indujo significativamente la expresión del gen de TRHen el grupo con AII con el sistema de TRH intacto no evidenciándose esteaumento en el grupo que tenía el sistema de TRH bloqueado confirmando laefectividad de la maniobra de bloqueo. Este resultado fue confirmado a nivelproteico mediante la técnica de inmunofluorescencia (p<0.01). A favor delefecto hipertrófico en estas células observamos que la AII indujo un aumentosignificativo (p<0.05) en la expresión del gen marcador de hipertrofia BNPque no fue observado en el grupo que recibió AII y tenía el sistema de la TRHpreviamente bloqueado por siRNA. Elconjunto de resultados tanto ?in vivo? como ?in vitro? en ambos tipos celularesfibroblastos y miocitos nos permiten ubicar a la TRH como uno de los mediadoresde los efectos fibróticos e hipertróficos que ejerce a través de los receptoresAT1 en roedores, nunca antes descripto.

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