Cuerpos de inclusión, fuente de enzima activa con propiedades estructurales particulares.

BIANCO, MJ; FLORES, S; PERILLO MA; SANCHEZ JM

Santiago del Estero

Congreso; XLIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2015

La sobreexpresión de proteínas en E.coli mediante ingeniería genética, en determinadas condicionesllevar a la formación de agregados intracelulares enriquecidos en la proteínaheteróloga, llamados cuerpos de inclusión (CI). Dado su tamaño (1 µm dediámetro), los  CI pueden ser  aislados del resto del contenido celular porcentrifugación. Nosotros demostramos que los CI de b-galactosidasarecombinante (b-Gal) pueden hidrolizar lactosa. El objetivo de estetrabajo fue producir CI de β-Gal recombinante (CIβ-Gal) y evaluar lascaracterísticas funcionales y la estabilidad estructural de la b-Gal presente eno liberada del CI. Para obtener CI, el pellet de la centrifugación del cultivo debacterias lisadas, se sometió a lavados con buffer fosfato/Tritón X-100 (50 mM)y luego buffer sin detergente, mediante centrifugación a 10000 rpm x 10 min. Elpellet final se utilizó para evaluar la funcionalidad de los CIβ-Galfrente al pH y a la temperatura. Además, se realizaron lavados periódicos delpellet y se evaluó la funcionalidad y la estructura de la enzima presente en elsobrenadante (b-GalCI), proveniente de la desorción deproteína desde  los CIβ-Gal.Los CIβ-Gal conservaron un 70% deactividad catalítica, dentro del rango de pH 3-6, en el cual la proteínasoluble es totalmente inactiva, y exhibieron un perfil de actividad frente a latemperatura similar al de la proteína soluble. El análisis de la actividad de la enzima presente en elsobrenadante de las centrifugaciones diarias demostró que los cuerpos deinclusión fueron capaces de prevenir la inactivación inducida por laconservación de la enzima a 4°C (heladera) por tiempos prolongados, observadacon la enzima soluble. Además, mediante estudios de fluorescencia intrínsecademostramos que b-GalCI presenta una estructura más compactaque b-Gal (lmax de b-GalCI =337 nm y lmax de b-Gal =340 nm).