INVESTIGADORES
LOPES Christian Ariel
congresos y reuniones científicas
Título:
Caracterización preliminar de la toxina killer Sekt producida por Saccharomyces eubayanus
Autor/es:
VILLALBA L.; LOPES C.A.; ROBLEDO E.; DEL MÓNACO S.; SANGORRÍN M.P.
Reunión:
Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología (CAM 2013) y II Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DIMAyA); 2013
Resumen:
El fenómeno killer en levaduras ha sido descripto en diferentes especies, pero
no hay reportes en Saccharomyces eubayanus. El objetivo de este trabajo fue
evaluar la capacidad killer de 13 cepas de S. eubayanus aisladas de Araucaria
araucana y realizar la optimización de las condiciones de producción
de la toxina killer producida por una de ellas, su caracterización bioquímica
preliminar y su posible modo de acción.
Seis cepas produjeron toxinas killer en ensayos en medio YPD-MB y fueron
resistentes a las toxinas producidas por las otras cinco, indicando que podría
tratarse del mismo tipo de toxina denominada SeKT.
Se seleccionó la cepa productora NPCC 1302 y su producción se optimizó mediante
un Diseño Estadístico Experimental (DEE) utilizando medio YPD (pH
4,5) con diferentes condiciones de agitación, temperatura, concentración
de tritón y glicerol. El extracto crudo de toxina se obtuvo por precipitación
con sulfato de amonio 80% p/v, centrifugación seguida de diálisis en buffer
citrato-fosfato 0,1M pH 4,5 y concentración con azúcar. La determinación
cuantitativa de la actividad killer se realizó por medición de DO 630 nm a las
48h a 20°C en medio líquido (YPD), utilizando Candida glabrata NPCC 106
como levadura sensible. El peso molecular de SeKT se estimó por filtración
con membranas de diferente cut-off. La actividad beta-glucanasa se cuantificó
utilizando p-nitrofenolglucósido como sustrato. Se determinó el blanco en la pared celular por competencia con polimeros: laminarina, pustulano,
pululano, Concanavalina A, curdlano, manano y quitina. Se determinaron
los efectos de SeKT a nivel subcelular sobre C. glabrata por microscopía de
fluorescencia, empleando tinción doble con Ioduro de Propidio y Hoechst
33342 para evaluar muerte celular.
La condición óptima de produccion de SeKT por el DEE fue: YPD con 0,1% v/v
de tritón y 5% v/v de glicerol, 13°C y 120 rpm. La síntesis de SeTK se observó
antes del inicio de la fase estacionaria de crecimiento, el peso molecular fue
mayor a 30KDa y presentó actividad beta-glucanasa. SeTK fue además capaz
de inhibir el crecimiento de Brettanomyces bruxellensis NPCC 114, especie
contaminante de vinos.
Los resultados obtenidos frente a polimeros de pared, indicarían que los
blancos primarios podrían ser los glucanos (manano, laminarina y curdulano)
y la quitina, ya que su actividad killer disminuyó en presencia de estos
compuestos en el medio.
En cuanto al mecanismo de accion subcelular, los resultados indican un
máximo de acción a las 3hs, donde más del 90% de células presentan núcleos
anormales con condensación y fragmentación del ADN y un 70% de las mismas
muestran pérdida de la integridad de la membrana. A las 24 y 48hs todas
las células muertas presentan características apoptóticas evidenciando una
continuidad del proceso de muerte.