Desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de neuraminidasa recombinante del virus de Influenza A.

LAURA E. FALETTI; NICOLAS URTASUN; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; GUSTAVO J. LEVIN; MARÍA V. MIRANDA

Buenos Aires

Congreso; ETIF 2012, VII Congreso y Exposición para la producción farmacéutica, biotecnológica y veterinaria.; 2012

Las vacunas tradicionales para la gripe están preparadas con virus inactivados producidos en cultivo en huevos de gallina embrionados. Frente a una pandemia, una alternativa para la producción rápida y masiva de vacunas es la expresión recombinante de los principales antígenos virales. Los antígenos virales del virus de influenza son proteínas glicosiladas y que presentan puentes disulfuro. Una de ellas, la neuraminidasa (NA) es una glicoproteína homotetramérica de ~240 kDa presente en la envoltura del virus. La NA es una de las proteínas antigénicas más importantes ya que está sujeta a variaciones antigénicas periódicas. Los anticuerpos anti-NA restringen la diseminación del virus y actúan disminuyendo la severidad de los síntomas de la enfermedad. En el presente trabajo, se estudió la expresión de dos variantes (con y sin dominio transmembrana) de NA proveniente de la cepa viral Influenza A H1N1 en células de insecto (Sf9) y larvas de lepidópteros (Rachiplusia nu). Ambas variantes de NA presentaron el peso molecular esperado de aproximadamente 60 kDa. Los ensayos de actividad biológica indicaron que la NA con transmembrana (NA con-Tm) se localizó en el medio intracelular, mas específicamente unida a la membrana como se pudo comprobar con ensayos de inmunofluorescencia. Al cuarto día post infección el 39 % de NA con-Tm se localizó en el medio de cultivo donde se registró la máxima actividad. El rendimiento en lisados celulares fue de 9,97 ± 0,74 mg/l de cultivo y en sobrenadantes de 6,57 ± 0,51 mg/l. La NA sin dominio transmembrana (NA sin-Tm) se secretó al medio de cultivo. La actividad biológica medida para esta variante fue baja en lisados celulares incrementando en el sobrenadante a lo largo del tiempo, sin embargo, esta resultó 5 veces menor comparada con la actividad de la NA con-Tm. El rendimiento fue de 0,72 ± 0,12 mg/l en lisados celulares y 1,95 ± 0,057mg/l en el sobrenadante. La producción de NA en R. nu fue de 1,2 ± 0,197 mg/g de larva. Además, esta NA pudo ser parcialmente purificada a través de una cromatografía de pseudoafinidad usando concanavalina A como ligando. Para producir 1 mg de NA recombinante son necesarios 153 ml de cultivo de células en suspensión o seis larvas. El antígeno NA pudo ser expresado eficientemente en células y larvas de insecto conservando su forma biológicamente activa. La eliminación del dominio transmembrana resultó una estrategia que promovió la secreción de NA al medio de cultivo pero estaría afectando la formación de la estructura cuaternaria. Hemos demostrado que R. nu es capaz de producir altos niveles de NA biológicamente activa. El sistema de baculovirus/larvas de insecto es una alternativa interesante para la producción de antígenos virales de influenza.