Secuenciación de nueva generación (NGS) como herramienta mejorada para la detección de virus de amplio espectro en plantas de vid

CUELLO, R. A. ; ZAVALLO, D. ; DEBAT, H.; VERA, P. ; LANZA VOLPE, M. ; SATTLER, A.; PUEBLA, A. ; GÓMEZ TALQUENCA, S. ; ASURMENDI, S.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Simposio; XIV Simposio Redbio Argentina; 2023

Asociación Civil Redbio Argentina

La vid es el frutal más importante de la Argentina en términos de superficie cultivada como así también en volumen de producción. La naturaleza perenne de ésta y su propagación agámica contribuyeron a que sea un reservorio natural de un gran número de virus y viroides, lo que se asocia a una serie de enfermedades de gran impacto económico. Por lo tanto, el uso de material de propagación libre de virus, como así también la continua prospección del material implantado, es clave para la sustentabilidad y rentabilidad de los viñedos. Las tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS), cuya función es la de posibilitar la secuenciación de ADN/ARN a gran escala, permite la identificación de patógenos (a nivel especie/cepa) sin requerir conocimiento previo de los mismos, a diferencia del método gold standard actualmente utilizado para certificar material libre de patógenos a través de RTqPCR.Nos propusimos desarrollar un método completo de detección de virus de amplio espectro para vid mediante el uso de NGS a costos reducidos. Para ello primero testeamos la sensibilidad y especificidad de la técnica NGS en nuestras condiciones locales. Se secuenciaron cuatro variedades de vid (previamente analizadas por el panel de detección estandarizado mediante RTqPCR) correspondientes a Malbec (MB21), Chardonnay (CH40), Criolla (171) y un portainjerto de Criolla (P1103) con una cobertura de más de 100 millones de lecturas por muestra. Sin embargo, al analizar los datos, se detectó una abundante presencia de Grapevine Pinot Gris Virus (GPGV) y Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV) (no incluidos en el panel de detección convencional que se utiliza habitualmente) en todas las muestras, así como algunos virus y viroides en menor proporción en algunas de ellas. Los datos corroboraron la capacidad de esta técnica para detectar patógenos sin requerir información previa demostrando, además, una alta sensibilidad. Se volvieron a analizar las muestras por qPCR utilizando primers específicos para GPGV y se corroboró la presencia del mismo, mientras que algunos de los detectados en menor proporción por NGS no pudieron ser amplificados.Luego nos centramos en optimizar la metodología para reducir costos, tornándola asi conveniente para su adopción. Se está poniendo a punto el desarrollo de un sistema sustractor que permita concentrar el RNA viral al remover los RNA’s endógenos (RNAs no codificantes y mensajeros de la planta) que resultaron ser más del 90% de las lecturas secuenciadas. Este proceso permitirá mejorar el ratio RNA viral/RNA endógeno. En una siguiente etapa y a partir del aumento de la sensibilidad de la técnica se podrán multiplexar varias muestras en una misma corrida del secuenciador, manteniendo la misma capacidad de detección pero reduciendo grandemente los costos.