Aislamiento, caracterización y purificación de una proteasa serínica (HtrA) de Helicobacter pylori, un potencial blanco terapéutico para erradicar la infección.

ANABELLA L. ORIGONE; DIEGO A. VALLÉS; ÁNGEL GABRIEL SALINAS IBÁÑEZ; ALBA E. VEGA; SONIA E. BARBERIS

Santiago de Chile

Simposio; IV Simposio Latinoamericanos de Biocatálisis y Biotransformaciones (SiLaByB) y III Jornada de Biocatálisis (JBiocat).; 2022

Universidad de Santiago de Chile (USACH)

PRESENTACIÓN ORAL ----------------------------------------------------------------------------------------------------- Helicobacter pylori es un importante patógeno que coloniza el epitelio gástrico y daña la integridad de la mucosa induciendo ulceras y cáncer gástrico a través de sus factores de virulencia. Entre ellos se incluyen una proteína codificada por el gen A asociado a citotoxina (CagA), una citotoxina vacuolizante A (VacA) y una serina proteasa A (HtrA). Las proteínas HtrA representan una clase de proteasas serínicas inducidas por choque térmico que están involucradas en la interrupción de las uniones estrechas y adherentes de las células epiteliales. En H. pylori, el desprendimiento de la proteína de adhesión E-cadherina altera las funciones de la barrera epitelial permitiendo que el microorganismo acceda al espacio intercelular durante la infección. El objetivo de este trabajo fue aislar, caracterizar y purificar la proteasa serínica HtrA de H. pylori, para estudiarla como un posible blanco terapéutico relevante. La cepa de referencia H. pylori NCTC 11638 fue cultivada en agar sangre e incubada 48 h a 37 °C en condiciones de microaerofilia. Las colonias fueron colectadas y suspendidas en caldo infusión cerebro - corazón para favorecer la secreción de HtrA. La suspensión se incubó a 37 °C con agitación a 160 rpm durante 8 h, se centrifugó inmediatamente a 13.000 × g durante 10 min a 5 °C y se recogió el sobrenadante para su posterior purificación. El proceso de purificación se realizó en un equipo FPLC (Akta Prime Plus, General Electric), utilizando una columna cromatográfíca de intercambio catiónico HiTrap SP (Cytiva Global Life Sciences Solutions USA LLC) empacada con Sulfopropil-Sepharose, previamente equilibrada y lavada con buffer Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). La elución se realizó con un gradiente lineal de cloruro de sodio (0-0,2 M) en el mismo tampón de partida, a una velocidad de flujo de 2 mL/min. La cromatografía se controló espectrofotométricamente midiendo la absorción a : 280 nm. Se analizó la actividad caseinolítica de las fracciones colectadas; las que resultaron activas se concentraron y almacenaron a -20 °C. Se realizaron zymogramas del sobrenadante y de las fracciones purificadas. Las bandas de proteína se tiñeron en solución acuosa de Coomassie Brillant Blue R-250 0,2% (p/v) con etanol 30% (v/v) y ácido acético 7% (v/v). Es conocido que la familia de proteasas HtrA contienen un dominio tipo quimotripsina en el N-terminal y al menos un dominio PDZ en el C-terminal, se ensamblan en oligómeros que conforman trímeros y éstos pueden dar formas oligoméricas superiores (Hansen y Hilgenfeld, 2013). En el sobrenadante se detectaron al menos un monómero HtrA y dos oligómeros proteolíticamente activos, los cuales fueron separados por electroforesis SDS-PAGE. Las bandas fueron cortadas y analizadas por espectrometría de masa. Se proyecta realizar estudios de estructura – actividad que permitan encontrar inhibidores específicos de la proteasa HtrA secretada por H. pylori, los cuales podrían ser nuevos agentes terapéuticos para erradicar la infección.