Impacto del Remodelamiento de envoltura en la exposición de proteínas heterólogas sobre la superficie de BAL mediante la endolisina del fago PL-1.

GORDILLO, TANIA BELEN; GRADASCHI, VICTORIA; BOCKOR, SABRINA SOL; ALLIEVI, MARIANA CLAUDIA; PIURI, MARIANA; RUZAL, SANDRA M; PALOMINO MARÍA MERCEDES

José C Paz

Jornada; II JORNADAS LATINOAMERICANAS DE BACTERIOFAGOS; 2022

Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), han sido consideradas microorganismos con status GRAS(Generalmente Reconocidos como Seguros), asociados a la fermentación y preservación dealimentos. Además, muchas cepas presentan características probióticas. La endolisina del fagoPL-1 de Lacticaseibacillus paracasei tiene una estructura bi-modular con un dominio catalíticocon actividad muramidasa en su extremo N-terminal y un dominio de unión a pared celular(CBD) en su extremo C-terminal. Este último puede ser utilizado como dominio “carrier”, parala exhibición en superficie de BAL de péptidos o proteínas de interés industrial y/ofarmacéutico. El objetivo principal del presente trabajo es evaluar el CBD de la endolisina delfago PL-1 como dominio de anclaje para unir proteínas funcionales a la superficie de BAL nomodificadas genéticamente y cómo los cambios en envoltura que surgen de una preadaptación a condiciones de hipersalinidad podrían influir en esta unión. Para ello, en primerlugar, se produjo la proteína quimera GFP-CBDLys en un sistema de expresión heterólogo en E.coli para posteriormente realizar los ensayos de binding sobre la superficie de BAL. Los mismosfueron evaluados por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. De esta forma seconsigue una formulación de grado alimentario que no contenga microorganismosgenéticamente modificados, prevaleciendo el status seguro de los mismos. Por otro lado,hemos evaluado cómo influyen los cambios estructurales a nivel de envoltura en el binding delCBD cuando L. paracasei es pre crecido en presencia de distintas concentraciones de NaCl. Seha observado un aumento significativo del binding de 2,5 veces cuando L. paracasei es precrecido en MRS 0,75M. El análisis de expresión por medio de la técnica qPCR de distintosgenes de síntesis de los principales polímeros de pared (CWPS y LTA) ha demostrado unainhibición en la expresión de los mismos cuando L. paracasei es pre adaptado en alta sal.Además, se estudió si las células decoradas en alta densidad con la proteína “carrier” comotambién las modificaciones que ocurren a partir de la pre adaptación en alta sal podrían influiren el proceso infeccioso fago-bacteria, para ello se realizaron cinéticas de adsorción de PL-1 aL. paracasei comparando condición control contra tres tipos celulares. Se observó que no haydiferencias en la cinética de adsorción de la cepa decorada con la proteína “carrier”, sinembargo se observó una disminución significativa cuando la misma es precrecida en alta sal.Estos resultados destacan el potencial uso de microorganismos genéticamente no modificadospara el delivery de biomoléculas mediada por el CBD de la endolisina del fago PL-1, se hacorroborado que el pre crecimiento en alta sal permite maximizar la exhibición de proteínasheterólogas sobre la superficie de BAL. Las modificaciones que ocurren a nivel de polímeros depared a partir de análisis de expresión podrían explicar la optimización de la exhibición comotambién las diferencias observadas en las cinéticas de adsorción.