Diseño y optimizaci¨®n de un protocolo de cuantificaci¨®n de actividad enzim¨¢tica en CLEAs de Thermomyces lanuginosa (TLL)

M.P. GUAUQUE TORRES; M. L. FORESTI; M. L. FERREIRA

Montevideo

Congreso; IV Encuentro Regional de Biocat¨¢lisis y Biotransformaciones; 2010

Universidad del Uruguay

La s¨ªntesis de agregados enzim¨¢ticos entrecruzados (CLEAs) es una t¨¦cnica de bajo costo y alto inter¨¦s en la producci¨®n de biocatalizadores. Su preparaci¨®n implica cambios en el estado de hidrataci¨®n de la mol¨¦cula o en la constante diel¨¦ctrica del medio que permitan la interacci¨®n hidrof¨®bica entre enzimas, conduciendo a la formaci¨®n de agregados f¨ªsicos. La estabilidad necesaria para los CLEAs se obtiene gracias a su entrecruzamiento usando una mol¨¦cula bifuncional como glutaraldeh¨ªdo [1]. Para la correcta determinaci¨®n de la actividad espec¨ªfica (¦Ìmol/min-mg) en CLEAs de la lipasa de TLL, fue necesaria la resoluci¨®n de diversos problemas que implicaron: a) determinar la cantidad de prote¨ªna precipitable (PP) presente en la soluci¨®n inicial comercial; b) optimizar la reacci¨®n test y determinar rangos de respuesta lineal a la concentraci¨®n de PP; c) realizar balances de masa tendientes a cuantificar la cantidad de PP presente en el CLEA por sustracci¨®n de la cantidad encontrada en sobrenadantes (SN) y aguas de lavado (W1-3); y d) utilizar alb¨²mina de suero bovino (BSA) como aditivo de precipitaci¨®n [2]. En el presente trabajo se aborda el caso particular de la problem¨¢tica experimental asociada a la determinaci¨®n de actividad enzim¨¢tica en CLEAs que utilizan (NH4)2SO4 como agente de agregaci¨®n. Dado que esta sal es de uso habitual en la literatura de CLEAs resulta de inter¨¦s optimizar el protocolo de determinaci¨®n de actividad correspondiente. En este contexto, se analiz¨® la influencia de iones provenientes de la sal precipitante en la acidez titulable dentro de la reacci¨®n de hidr¨®lisis de triole¨ªna, para lo cual se titularon dos al¨ªcuotas de SN, W1-3 y CLEAs  en diferentes condiciones: con y sin reacci¨®n. De esta forma se encontr¨® cu¨¢nto del t¨ªtulo obtenido en la reacci¨®n era asignable a hidr¨®lisis por enzima entrecruzada, y cu¨¢nto era asignable a la titulaci¨®n de los iones NH4+ provenientes de la sal precipitante.  As¨ª mismo, se determin¨® un efecto importante de interacci¨®n entre los iones de (NH4)2SO4 y el glutaraldeh¨ªdo disponible para entrecruzamiento.