Hacia la identificacion de los componentes del complejo que biosintetiza ubiquinona en Trypanosoma brucei

POROPAT E; ORTIZ GE; PRAVIA CA; BONTEMPI EJ

Buenos Aires

Encuentro; XXV Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2012

SAP

La ubiquinona (UQ) cumple una función central en el metabolismo de Trypanosoma brucei. Está involucrada en la regeneración del NADH, el mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial y el equilibrio redox. La UQ está compuesta por una cadena isoprenílica y un anillo de benzoquinona. Nuestro grupo está validando como blanco de drogas a la solanesil difosfato sintasa, enzima que sintetiza a la cadena y que presenta localización glicosomal en T. cruzi (J Biol Chem 2006;281(51):39339?48) y mitocondrial en T. brucei (Mol Biochem Parasitol 2012;183:189? 192). En levaduras las proteínas que transfieren la cadena y que modifican el anillo de benzoquinona conforman un complejo mitocondrial. La necesidad funcional de un complejo podría aumentar la eficacia de inhibidores dirigidos a alguno de los componentes. Dado que estudios proteómicos han identificado en T. brucei casi todas las proteínas homólogas, nos propusimos estudiar si forman un complejo e identificar a sus componentes. Elegimos la técnica de Tandem Affinity Purification, que además de facilitar la separación del complejo por dos cromatografías de afinidad sucesivas, permite localizar la proteína de fusión por inmunofluorescencia. Las proteínas pueden identificarse realizando espectrometría de masas de las bandas proteicas separadas en gel de poliacrilamida. Se generaron tres construcciones, clonando tres de los genes de interés en el vector pLew79 MH TAP. Luego de secuenciarlas se transfectaron procíclicos de la cepa 29-13. Los transfectantes estables fueron evaluados por PCR y western blot. Se discutirá el avance del proyecto y las implicancias de la localización subcelular para mejorar el ?delivery? de drogas.