PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS DE ASPERGILLUS SPP. POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO: UN ESTUDIO COMPARATIVO

ORTIZ G; NOSEDA DG; PONCE MORA MC; CAVELLO I; BLASCO M; ALBERTÓ E

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción: Las proteasas son enzimas que catalizan la degradación de proteínas a pequeños péptidos y aminoácidos, de gran importancia para la industria farmacéutica y de los alimentos. Las mismas pueden ser aisladas de plantas, animales y microorganismos, estos últimos ampliamente utilizados para su producción debido a su amplia diversidad biológica. Dentro de los microorganismos, los hongos filamentosos del género Aspergillus y en particular las especies A. oryzae y A. niger producen un gran número de proteasas tanto en fermentación sumergida como sólida, activas en un amplio rango de pH y es por ello que son ampliamente utilizados para la producción industrial de estas enzimas. En este contexto, la mayor parte del conocimiento científico actual vinculado con la producción de proteasas dentro del género Aspergillus se encuentra relacionado con la utilización de las especies A. oryzae y A. niger. En virtud de ampliar el repertorio de cepas empleadas para la producción de estas enzimas, el objetivo de nuestro trabajo es realizar un estudio comparativo de la producción de proteasas empleando diferentes especies del género Aspergillus y establecer nuevas cepas que resulten de interés para la producción de las mismas. Metodología Estado del Arte: Los antecedentes relacionados con la producción de proteasas en Aspergillus spp, se evaluó a través de una búsqueda bibliográfica en la base de datos Scopus empleando el siguiente criterio de búsqueda: TITLE ((Aspergillus AND Proteases) AND Production). Microorganismos y condiciones de cultivo: Cepas del Aspergillus: 1) A. terreus IIB-INTECH 744/11; 2) A. oryzae NRRL 2217; 3) A. awamorii NRRL 356; 4) A. flavipes-like NRRL 295; 5) A. kawachii IFO 4308; 6) A. sp 7/14 IIB-INTECH; 7) A. japonicus NRRL 1782; 8) A. oryzae IIB-INTECH 8/12; 9) A. giganteus NRRL 10; 10) A. rhizopodus NRRL 6136; 11) A. sojae NRRL 5595; 12) A. sojae ATCC 20235, fueron crecidas a 28°C en medio agar-melaza hasta conidiación. Los conidios se resuspendieron en Tween 80 al 0,08%. La fermentación en estado sólido se efectuó a 28°C en frascos conteniendo un gramo de mezcla 70:30 de salvado de trigo y cáscara de naranja humedecido al 110% con medio Czapek-Dox e inoculados con una suspensión de 1x106 conidios/gramos de sustrato. Obtención de extractos enzimáticos: Las enzimas fueron recuperadas mediante la adición de 10 ml de agua por gramos de sólido seco, la mezcla se agitó durante 30 min a 250 rpm y 28°C. Posteriormente, los extractos fueron filtrados y centrifugados a 1900 g por 20 min. Evaluación cualitativa de la actividad proteolítica: Placas de Petri conteniendo 1% p/v agar leche en buffer Tris-HCl 0,1 M (pH variable: 6-9) se perforaron con sacabocados de 5 mm de diámetro y los pocillos se cargaron con 15 µl de los extractos enzimáticos. Las placas se incubaron a 30°C por 24 hs, se tiñeron con Coomassie Blue y se determinaron los índices de hidrólisis como el logaritmo de la diferencia entre las áreas de hidrólisis y del pocillo. Determinación cuantitativa de la actividad proteolítica: 20 µl de diluciones de cada extracto enzimático en 0,1M Tris-HCl (pH 8) se mezclaron con 50 µl de azocaseina al 1% (p/v) en 0,1M Tris-HCl (pH 8) (buffer T8) incubando a 37°C por 1h. Posteriormente, se adicionó 150 µl de ácido tricloroacético al 10% p/v. Las mezclas fueron centrifugadas a 2000 g por 10 min y se determinó la absorbancia de los sobrenadantes a 415 nm. Una unidad de actividad proteolítica (UP) se define como la cantidad de enzima que produce un cambio en 0,1 de absorbancia a 415 nm por minuto en las condiciones de reacción mencionadas. SDS-PAGE y Zimograma: Las muestras se diluyeron en buffer de carga sin DTT para obtener una concentración final de 10 U/ml. Cada muestra fue sembrada en un gel SDS-PAGE 10%, por duplicado y de forma especular, efectuando la electroforesis a 160 V durante 1h a 4°C. El gel se incubó en solución 2,5% de Tritón X-100 en buffer T8 durante 60 min con agitación constante. El gel se lavó con buffer T8 y se cortó a la mitad. Se tiño una parte con Coomassie Blue y la otra mitad se incubó con 1% (p/v) de caseína en buffer T8 a 37°C durante 30 min, se enjuagó con agua destilada y tiñó con Coomassie Blue coloidal. Resultados: El análisis del estado del arte permitió establecer que más del 60% de las citas bibliográficas correspondientes con la producción de proteasas en el género Aspergillus se encuentran relacionadas con el empleo de cepas de A. niger y A. orizae, seguidas por A. terreus, A. flavus y A.clavatus (Fig. 1). A partir de la evaluación cualitativa se consiguió determinar que A. oryzae NRRL 2217, A. flavipes-like NRRL 295, A. oryzae IIB-INTECH 8/12, A. giganteus NRRL 10 y A. sojae ATCC 20235 presentaron los mayores niveles de actividad proteolítica para todos los valores de pH y tiempos de incubación examinados (Fig. 2). Indicando que los extractos enzimáticos obtenidos de las mismas presentan un amplio rango de pH. Asimismo, mediante el estudio cuantitativo se logró establecer que las cepas mencionadas presentan valores elevados de productividad de proteasas respecto del resto de las cepas analizadas (Fig. 3). Cabe destacar que la productividad enzimática de las mismas fue mayor al día 2 (Fig. 3). Finalmente, por medio del SDS-PAGE y zimograma se pudo evaluar el número de proteasas presentes y estimar sus pesos moleculares a partir de los extractos enzimáticos correspondientes a las cepas con mayores productividades (Fig. 4). De este modo se consiguió determinar que Aspergillus sojae ATCC 20235 produce al menos 10 proteasas diferentes con un rango de peso molecular entre 88 y 19 KDa. Conclusiones: Los resultados obtenidos en este trabajo permitieron establecer que la cepa ATCC 20235 de Aspergillus sojae presentó un extenso repertorio de enzimas proteolíticas y activas en su conjunto en un amplio rango de pH. Así mismo dicha cepa presentó mayor productividad proteolítica respecto a las otras cepas evaluadas. Debemos destacar que dicha productividad fue alcanzada en un corto periodo de fermentación, lo cual reduce el costo energético del proceso, esto sumado al empleo de residuos agro-industriales como sustrato para la fermentación convierte a este bioproceso en rentable y sustentable. Cabe resaltar que, este es el primer reporte donde se emplea A. sojae en la producción de proteasas.