IDENTIFICACIÓN Y PERFIL ENZIMÁTICO DE LEVADURAS ADAPTADAS AL FRÍO AISLADAS DEL PARQUE NACIONAL TIERRA DEL FUEGO

CAVELLO I; FERNANDEZ PREISEGGER M; ORTIZ G; CAVALITTO S

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción La biotecnología pretende hacer uso de la biodiversidad del planeta para producir o modificar sustancias útiles. Razón por la cual, la biodiversidad y la biotecnología se encuentran en estrecha relación. A mayor conservación y conocimiento de la biodiversidad, existirán más oportunidades para hacer uso del recurso biotecnológico. El desarrollo de nuevos productos y procesos ?claves en el desarrollo futuro de la biotecnología- depende del hallazgo de nuevas fuentes de materiales biológicos, así como de la creatividad y de la capacidad de los investigadores para descubrir, evaluar y desarrollar dichas fuentes. En la producción de alimentos y bebidas, actualmente existe una tendencia a emplear condiciones cada vez menos drásticas, alentando de este modo el uso de enzimas capaces de ser activas en frío como un modo de evitar el deterioro y posibles modificaciones nutricionales de los productos finales. Es aquí donde encuentran su nicho los microorganismos adaptados al frío por ser potencial fuente de enzimas activas a bajas temperaturas. En comparación con los hongos y las bacterias, las levaduras no se consideran particularmente ricas en enzimas industrialmente relevantes. Sin embargo, especies como Kluyveromyces lactis o Yarrowia lipolytica son ejemplos de levaduras aplicadas a la producción de enzimas a nivel industrial. O como la recientemente encontrada en la Patagonia Argentina, Saccharomyces eubayanus una nueva especie que se utiliza en el desarrollo de la diversificación productiva de vino, sidra y cerveza mediante fermentaciones a bajas temperaturas. El objetivo del siguiente trabajo fue aislar, identificar y caracterizar por el perfil de actividades enzimáticas las levaduras aisladas de muestras de tierra de la Bahía Encerrada (Ushuaia) y el Parque Nacional de Tierra del Fuego. Metodología Durante el mes de Julio del 2014 se recolectaron diferentes muestras de tierra de Bahía Encerrada y del recorrido principal del Parque Nacional Tierra del Fuego, las muestras fueron tomadas de la superficie y de una profundidad de 30 cm, colocadas en recipientes estériles y conservadas a 4°C hasta el momento de su procesamiento. El aislamiento de las levaduras adaptadas al frio se llevó a cabo mediante dos metodologías independientes. Una porción de tierra de cada muestra se resuspendió en agua destilada estéril y posteriormente 50 y 100 l de las mismas se sembró sobre Glucosa Cloranfenicol Agar (GCA). En tanto que otra porción fue sometida a un primer enriquecimiento en caldo Sabouraud y al cabo de 5 días de incubación a 6 y 15°C, 50 y 100 l de cada uno de ellos se sembró en GCA. En ambos casos, las placas de GCA se incubaron a 6 y 15°C durante una semana con observación diaria para el aislamiento de diferentes levaduras basándose en la forma, brillo, tamaño, elevación, bordes, superficie, consistencia y color de las colonias. Los aislamientos se conservaron a 4 °C y a -80 °C con glicerol. A las cepas aisladas se les ensayó la capacidad de degradar almidón, caseína (agar leche), lípidos (aceite de oliva y Tween-80), pectina, celulosa, xilano e inulina. Las levaduras se inocularon en la superficie de las placas de agar conteniendo el sustrato a estudiar, incubando a 6 y 15 °C. La actividad enzimática se comprobó al cabo de 5 días de incubación. Aquellas levaduras que evidenciaron la producción de una o más enzimas extracelulares fueron luego identificadas mediante Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP-ITS). Para dicho análisis se emplearon tres enzimas de restricción: CfoI, HaeIII, HinfI. El patrón de bandas fue comparado con la base de datos de la Universidad de Valencia. Resultados Se aislaron un total de 51 levaduras capaces de crecer a 6 y a 15°C, 5 de ellas presentan una pigmentación entre las tonalidades rosa al salmón, haciendo suponer que las mismas podrían pertenecer a los géneros Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces o Sporidiobolus. Determinándose por medio del análisis de PCR-RFLP que las mismas pertenecían al género Rhodotorula spp. Al realizar el estudio de los perfiles enzimáticos de cada una de las especies aisladas, se comprobó que el 51% de los aislamientos presentaban la capacidad de producir al menos una enzima extracelular ?comprobada mediante la aparición de un halo de degradación en placas de agar con el sustrato en estudio-. Luego de 5 días de incubación, la levadura 8.1 demostró ser capaz de producir proteasas, lipasas, celulasas e inulinasas. En tanto que otros 5 aislamientos presentaron la capacidad de secretar dos tipos de enzimas extracelulares cada uno. No se detectó en ninguno de los aislamientos la capacidad de producir xilanasas ni amilasas. Un total de 26 levaduras fueron identificadas molecularmente mediante el análisis de ITS1-5.8S-ITS2 PCR-RFLP. En todos los casos, las bandas de la amplificación obtenidas presentaron tamaños menores que Saccharomyces cereviciae sensu stricto que tiene un tamaño de 850 pb, confirmando los resultados obtenidos durante las observaciones microbiológicas, las cuales clasificaban a estos aislamientos como no-Saccharomyces. Los aislamientos l 6.6; l 6.7; e 6.1; hle 6.2 se correspondieron con el patrón de Yarrowia lipolytica, en tanto que los aislamientos hle 5.1, hle 7.3, hle 7.3´, l 5.2 se correspondieron con patrones del tipo candida spp. El patrón de restricción del aislamiento hle 6.3 se correspondió con Pichia heedii. En tanto que el 46% de los aislamientos no pudo ser identificado dado que no se encontró un patrón similar en la base de datos. Conclusión La levadura l 8.1 es quien presenta un mayor espectro de producción de enzimas extracelulares tanto a 6 como a 15 °C, es considerado como uno de los aislados más promisorios para futuras aplicaciones industriales, siendo seleccionada para continuar estudiando más profundamente la expresión de sus enzimas realizando cultivos líquidos. Dado que no pudo ser identificada por medio de la técnica PCR-RFLP, se continuará con el trabajo de identificación molecular mediante la amplificación y posterior secuenciación del dominio D1/D2 del segmento 26S ADNr para concluir en su género y especie.