ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DEL PROMOTOR TOXA PARA LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN TRICHODERMA REESEI RUT C30

ORTIZ GE; ALBERIO V; ALBERTÓ E; BLASCO M

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

El género Trichoderma se encuentra compuesto por varias especies de hongos filamentosos que poseen como habitad natural el suelo, siendo T. reesei la especie de mayor relevancia industrial. La misma ha sido exitosamente empleada durante décadas para la producción de enzimas celulolíticas y actualmente es empleada como hospedador para la producción de proteínas recombinantes. Las principales características que posicionan a T. reesei como un adecuado sistema de expresión radican principalmente en su capacidad para secretar grandes cantidades de proteínas, capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales, de especial importancia cuando se considera la producción de proteínas heterólogas complejas y a la habilidad del mismo para crecer apropiadamente en sistemas de fermentación y medios económicamente rentables. En particular, el mutante hipersecretor T. reesei Rut-C30 ha sido utilizado en la producción de proteínas recombinantes de diversos orígenes entre las cuales se pueden mencionar glucoamilasa, endoquitinasa, β-glucosidasa, lacasa, lipasa y celulasa fúngicas; xilanasas bacterianas; endopeptidasas de origen vegetal; quimosina bovina y eritropoyetina humana. Sin embargo, los vectores utilizados para la producción de estas proteínas se basan en el empleo de promotores fuertes cbh1, cbh2 o modificaciones de los mismos, limitando así la plasticidad del sistema de expresión. En virtud superar este inconveniente, las investigaciones actuales se han centrado en la búsqueda de nuevos promotores funcionales en T.reesei Rut C30. El promotor toxA controla la expresión de la toxina A en el hongo Pyrenophora tritici-repentis, este promotor ha sido empleado con éxito para la expresión constitutiva de proteínas recombinantes en diversos hongos: Colletotrichum magna, P. tritici-repentis, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum trifolii, Verticillium dahliae, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Cochliobolus sativus, Fusarium sambucinum. Considerando que el promotor toxA ha resultado funcional en un amplio rango de hospedadores y teniendo en cuenta la necesidad de la búsqueda de nuevos promotores funcionales en T. reesei Rut C30, nos propusimos evaluar la funcionalidad de toxA en dicha cepa. Metodología Microorganismos y condiciones de cultivo: T. reesei RutC30 fue crecida a 28°C en agar papa glucosa para obtención de conidios y en medio liquido Mandel con 2 g/l glucosa para la expresión. La amplificación del vector se realizó en Escherichia coli DH5α . La transformación de T. reesei se realizó utilizando Agrobacterium tumefaciens BL1100Vector: Para el estudio funcional del promotor toxA, se empleó el vector pCBCT que posee el gen reportero sgfp río abajo del promotor toxA. Transformación: Los conidios fueron resuspendidos en Tween 80 al 0.08%, contados e inmediatamente empleados en para la trasformación siguiendo el protocolo descripto por Michielse y colaboradores, ?Agrobacterium-Mediated Transformation of the Filamentous Fungus Aspergillus Awamori,? Nature protocols, (2008). Extractos proteicos: Los micelios T. reesei Rut C30 y T. reesei RutC30 GFP fueron recuperados por filtración a partir de cultivos líquido crecidos durante 48 h a 28 °C y 250 rpm. 2 g de biomasa húmeda correspondiente a cada micelio fue tratada con nitrógeno líquido y triturada con mortero, los micelios procesados se resuspendieron en 1 mL de agua destilada y se cuantifico la proteína total por el método de Bradford. SDS-PAGE y Western blot: Los extractos proteicos se diluyeron en buffer de carga y se sembró 20 g de proteína total por calle en un gel SDS-PAGE 10%, la electroforesis se realizó a 160 V durante 1 h. Posteriormente las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se verificó la transferencia mediante tinción con rojo Ponceau. Posteriormente la membrana fue lavada con agua y bloqueada con 1% de leche descremada en TBS-0,1% Tween20 por 60 min a temperatura ambiente e incubada con anticuerpo primario (anti-GFP desarrollado en conejo) y secundario (IRDye® 800CW anti-Rabbit, LI-COR Biosciences) diluidos 1:1000 y 1:10000 en buffer de bloqueo con 0.05% Tween20, respectivamente. Para la inmunodetección la membrana se analizó empleando escáner infrarrojo.. Microscopía de fluorescencia: Una porción de micelio filtrado fue hidratado con agua destilada y analizado por microscopia empleando microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E600 equipado con cámara SPOT RT. Las imágenes superpuestas fueron obtenidas a partir de los canales correspondientes empleando el programa ImageJ versión 1.44. Resultados Como se muestra la figura 2 la presencia de la proteína verde fluorescente GFP citoplasmática en la cepa recombinante T. reesei RutC30 GFP indica la funcionalidad del promotor toxA en esta cepa. Así mismo, como es posible observar en el análisis de expresión por Western blot, T reesei RutC30 a diferencia de E. coli mostró una correcta expresión de SGFP hecho que puede ser evidenciado por la presencia de una única banda de esta proteína sin presencia de agregados proteicos, lo cual es posible observar para extractos purificados de SGFP recombinante producida en E. coli figura 3A. Conclusiones A partir de los resultados expuestos y considerando que este es el primer reporte para el estudio funcional del promotor toxA en T. reesei RutC30 es posible concluir que los resultados aquí presentados amplían el repertorio de promotores funcionales para esta cepa.