Producción de enzimas fúngicas en sistemas eucarioticos recombinantes

GONZALES J; ORTIZ G; ROJAS NL; CAVALITTO SF

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Micología, XXIII Jornadas Argentinas de Micología y 1a Reunión de la Asociación Micológica Carlos Spegazzini; 2014

La búsqueda de nuevas enzimas capaces de ser empleadas en procesos industriales es una actividad constante en la Biotecnología. Una vez detectado el biocatalizador con las propiedades buscadas, debe ser purificado para estudiar sus propiedades más relevantes y los factores que controlan su eficiencia en la aplicación deseada. Dado que el uso de las enzimas requiere de grandes cantidades de las mismas y que los hongos filamentosos suelen producir cantidades muy pequeñas de proteínas se plantea la necesidad de clonar y sobreexpresar dichas enzimas en sistemas heterólogos Una opción interesante en el caso de enzimas de origen eucarióticas es el uso de levaduras como hospedadores del vector de expresión ya que estos microorganismos son fácilmente cultivables en medios simples, poseen rendimientos celulares elevados (obteniéndose concentraciones finales de más de 20 g/l) y producen altas concentraciones de la proteína de interés. Si bien el clonado permite manejar la expresión del gen a voluntad, a los fines productivos la optimización de los componentes del medio de cultivo y el estudio del proceso de producción son etapas insoslayables desde el punto de vista tecnológico. En el presente trabajo se toma como ejemplo la expresión de una poligalacturnasa ácida de Aspergillus kawachii clonada en Saccharomyces cerevisiae. Los cultivos se realizaron en un fermentador de 1,5 l de capacidad máxima; New Brunswick, Bioflo 350 con control de O2 disuelto y pH. Se empleó un medio sintético conteniendo glucosa como fuente de carbono y energía (FCE) y urea como fuente de nitrógeno (FN). La cepa que se utilizó en los ensayos fue el clon de S. cerevisiae conteniendo el vector inducible por glactosa pYES2:PG1DI. La alimentación de los cultivos se realizó con el mismo medio concentrado con glucosa (en la etapa de acumulación de biomasa) o con glucosa/galactosa en la etapa de inducción. Se estudio la expresión realizando dos perfiles de alimentación cambiando la concentración de glucosa y dos perfiles de inducción cambiando la velocidad de flujo. Se alimento con 100 g/l y con 300 g/l de glucosa a un flujo de 26 ml/h y se indujo alternativamente con 100 g/l de glucosa y 50 g/l de galactosa a una velocidad de 9 ml/h y 27 ml/h respectivamente. La expresión de la enzima mostró una dependencia muy fuerte con el medio de la alimentación y, especialmente, del caudal de alimentación. Tal como se sospechaba, debido a la preferencia de las levaduras de consumir glucosa antes de otros azucares, la glucosa en el medio de cultivo se mantuvo en muy bajas concentraciones (por lo que no reprimió al promotor GAL1) mientras que la galactosa se acumuló, generando la inducción esperada sobre el promotor. De esta forma, alimentando con ambos azucares al mismo tiempo se consiguen los niveles más altos de expresión. En estas condiciones, la glucosa aporta la energía y el carbono necesario mientras que la galactosa permanece en el medio actuando como inductor de la expresión.