Caracterización parcial de un catalizador innovador para la producción de leche reducida en lactosa.

RAMÍREZ ANDREA C; BRACHO JUAN P; CAVALITTO SEBASTIÁN F; ORTIZ GASTÓN E

Posadas

Simposio; SAPROBIO 2021 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicosacional de Misiones; 2021

Universidad Nacional de Misiones

La β-galactosidasa o lactasa es la enzima que hidroliza lactosa en glucosa y galactosa. Dicha enzima, es ampliamente utilizada por la industria láctea en producir leche reducida en lactosa (LRL) y galactooligosacáridos (GOS) los cuales poseen actividad prebiótica. Para su empleo, esta enzima debe obtenerse con alto rendimiento y pureza.Dado que, la presencia de otras proteínas contaminantes como proteasas conducen a la formación de productos secundarios que conduzcan a propiedades organolépticas no deseadas. Sin embargo, la obtención de una enzima con alto grado de pureza requiere de técnicas cromatográficas de afinidad las cuales conducen a un aumento significativo en el costo final del producto (catalizador). En nuestro grupo de trabajo, hemos desarrollado una nueva herramienta biotecnológica para la producción, purificación e inmovilización de proteínas recombinantes empleando un novedoso sistema de etiquetado molecular. En este sistema, las proteínas recombinantes expresadas en sistemas heterólogos son fusionadas al dominio C-terminal de las proteínas de Capa-S de Lactobacillus sp. Luego, se emplea la afinidad intrínseca que posee dicho dominio por las membranas de las bacterias Gram + para realizar la purificación o inmovilización de las proteínas de interés. Considerando lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el sistema de etiquetado e inmovilización, para desarrollar un catalizador innovador que permita la producción de β-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum y su purificación en un único paso de una forma eficiente y económica. Para ello, se realizó la síntesis de una variante truncada de BbgII de B. bifidum fusionada al C-terminal del SlpA de L. bacillus y se transformaron E. coli Bl2aCodonPlus. La producción de la enzima se hizo en cultivos de E. coli con medio LB a escala Erlenmeyer e induciendo con 0,5 mM de IPTG. Posteriormente, los cultivos fueron cosechados por centrifugación durante 5? @5000 g, luego los pellets fueron lavados 2 veces con PBS y reconstituidos en buffer de lisis con Lisozima. Para obtener el homogenato, la suspensión de células fue sonicada y centrifugada durante 20? @ a2000g. A continuación, el lisado se clarificó por filtración y fue incubado en batch durante 2 horas a 25ºC con una matriz constituida por B. subtilis inactivado con formol 3%. De este modo se logró obtener, la enzima inmovilizada sobre la superficie de Bacillus subtilis. Posteriormente, se realizó la caracterización bioquímica de la enzima inmovilizada. Para ello, se evaluó el efecto de la temperatura, pH y cationes en la estabilidad y actividad de la enzima. Como resultado, se obtuvo que la enzima inmovilizada presenta actividad óptima a pH 6,2 y resulta estable en el rango de pH (4,6-8) durante dos horas reteniendo el 70% de su actividad máxima. Por otro lado, el catalizador presentó actividad óptima en un rango de temperatura de 40-60 °C y mostró buena actividad residual a bajas temperaturas. Finalmente bajo condiciones óptimas de pH 6,2 y temperatura de 50°C, se determinó la actividad enzimática de forma comparativa con formulados comerciales, como resultado pudo obtenerse valores de actividad comparables entre ambas enzimas. Estos resultados sugieren que, la β-galactosidasa recombinante de B bifidum inmovilizada sobre B. subtilis posee un comportamiento similar a las formulaciones comerciales y por lo tanto, la misma resulta promisoria para la producción de LRL.