Bioautografía en TLC de lacasa: identificación de inhibidores y diferenciación de captadores de radicales

CABEZUDO, IGNACIO; FURLAN, RICARDO L.E.

Congreso; XII Congreso Argentino de Química Analítica; 2023

Los ensayos denominados bioautográficos facilitan eldescubrimiento de moléculas bioactivas componentes de mezclas complejas. Endichos ensayos, se combinan la separación cromatográfica de las mezclas en unsistema cromatográfico abierto como es la cromatografía en capa delgada (CCD),con el posterior revelado biológico sobre la misma placa, permitiendo detectara los bioactivos dentro de las mezclas (Figura).1El pardeamiento es un problema para la conservación devegetales frescos y procesados. El mismo es causado por enzimas tales comopolifenol oxidasa (PPO), peroxidasa (POD) y lacasa.2 Por lo tanto, susinhibidores son potenciales agentes antipardeamiento. Si bien existen ensayossobre CCD para detectar inhibidores de PPO y POD, no se contaba hasta aquí conun ensayo para lacasa. Esta enzima cataliza la conversión oxidativa de fenolesa quinonas, y está ampliamente distribuida plantas superiores. En el ensayocolorimétrico tradicional de inhibición de lacasa, la reacción se hace enbuffer acuoso, por ende la solubilidad de compuestos es limitada. Además, dichoensayo no tiene control para detectar captadores de radicales, por lo que puedeconducir a errores de identificación de inhibidores.3  En nuestro ensayo, la enzima depositada sobre la placareacciona con ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),incoloro, produciendo el radical azul ABTS•. Los inhibidores de lacasa impidenla formación ABTS• y por lo tanto se pueden detectar sobre la placa comomanchas incoloras sobre el fondo azul. Los captadores de radical ABTS•, quetambién producen decoloración de la placa, se pueden discriminar de loscompuestos que inhiben la enzima empleando un ensayo control en el que el radicales generado químicamente (en lugar de enzimáticamente). De esta manera se pudodiferenciar un verdadero inhibidor de lacasa (azida de sodio) de unantioxidante captador del radical (ácido gálico). Además, se explorarondiferentes opciones para cubrir la placa con lacasa y ABTS utilizando enzima ensuspensión acuosa o inmovilizada en gel de agar, ambos formatos compatibles conplacas de CCD de fase normal. Para placas de fase reversa, se empleó enzimainmovilizada en un gel de poloxámero.4 El límite de detección de la azidasódica fue cuantificado mediante la visualización de la CCD y su escaneado a700 nm.1Cabezudo I, Salazar MO, Ramallo IA, Furlan RL, FoodChemistry, (2022) 132937.2Giménez P, Anguela S, Just-Borras A, Pons-Mercadé P,Vignault A, Canals JM, Teissedre PL, Zamora F, LWT, 154 (2022) 112871.3Johannes C, Majcherczyk A, Journal of Biotechnology78 (2000) 193–199.4García P, Ramallo IA, Furlan RLE, Phytochemicalanalysis 28 (2017) 101–105.Agradecimientos: CONICET. PIP- 11220200102423CO, FONCYT. PICT- 2019-02232, UNR ACRE PPCT 2023,PICT-2021-I-A-01034 y ASaCTEi. PEICID-2022-181.