BÚSQUEDA DE MUTACIONES CAUSALES DE HEMOFILIA. ALGORITMO DE ANÁLISIS MOLECULAR Y HALLAZGOS EN LAS SERIES ARGENTINAS

DE BRASI CD

Pergamino, Argentina

Simposio; Simposio Diagnóstico molecular de enfermedades ligadas al X. XXXVI Congreso de la Sociedad Argentina de Genética; 2007

SAG

La hemofilia es una coagulopatía hereditaria, ligada al cromosoma-X que afecta a 1 de cada 5.000 varones sin diferencias geográfico-étnicas. La hemofilia A (HA) y B (HB) son causadas por mutaciones deletéreas en los genes del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. La HA es cinco veces más frecuente que la HB como reflejo del mayor tamaño y complejidad del F8 sobre el F9 (186 kb-26 exones sobre 33 kb-8 exones). Entre las mutaciones causales de hemofilia, sólo las grandes inversiones del intrón 22 (Inv22) y del intrón 1 (Inv1) son claramente recurrentes causando la mitad de las HA-severas. Tanto en HA como en HB, el resto de las mutaciones causales en todo el rango de severidad, incluyen grandes y pequeñas deleciones e inserciones, defectos missense, nonsense, y del splicing. Las terapias sustitutivas del factor deficiente han mejorado significativamente la calidad de vida de los hemofílicos. El desarrollo de anticuerpo inhibidor terapéutico constituye la más seria complicación que afecta al 20% de los pacientes con HA y al 5% en HB. Entre los factores que predisponen al desarrollo de inhibidor se reconocen factores genéticos, ambientales y terapéuticos. El tipo de mutación causal de la hemofilia constituye el principal factor asociado a inhibidor. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un algoritmo de análisis molecular del F8 y F9 para todo el espectro de mutaciones causales de hemofilia. Aunque en continua revisión, este esquema incluye: en HA-severa primero se investiga la Inv22 por SI-PCR (shifting inverse-PCR), un nuevo abordaje diseñado por nosotros en reemplazo del Southern blot y los basados en PCR-larga distancia (LD-PCR); en los casos Inv22 negativos, la Inv1 por análisis PCR del sustrato ya preparado para estudiar la Inv22. En los casos restantes (HA y HB, severa y moderada-leve), se estudian las grandes deleciones (o inserciones) en probandos (hemicigotas) por análisis de PCR exón-específica seguida de LD-PCR para la obtención de una señal específica detectable en heterocigosis. El screening de mutaciones pequeñas se realiza por análisis de heterodúplex CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) de alta resolución y secuenciación de DNA. Los cambios genéticos obtenidos se analizan aplicando los criterios internacionales para asignación de causalidad. En cada familia, la simplificación del diagnóstico de la mutación pequeña se aborda por CSGE de menor resolución, o por detección de cambios en el patrón de restricción. Desde 1996 hemos estudiado más de 220 individuos de 81 familias con HA severa y 33 con HB. En HA severa se encontraron 36(44%) casos con la Inv22 y 1 Inv1; 10(12%) grandes deleciones; 13(19%) pequeñas Ins/Del; 8(10%) defectos missense, 7(9%) nonsense y 2 del splicing. Se describieron 17 micromutaciones asociadas a HA-severa, no reportadas en la base de datos HAMSTeRS. Las cuatro nuevas mutaciones missense fueron analizadas por modelado estructural. En HB, se caracterizaron: 1 deleción grande, 14(42%) defectos missense, 4(12%) nonsense, 1 del splicing, y 4(12%) pequeñas Ins/Del. Veintiún (49%) individuos estudiados para el F9, presentaron la variante de Malmö (polimorfismo neutro). En línea con lo observado en la literatura para HA, las grandes deleciones (>1 exón) muestran el mayor riesgo a desarrollar inhibidor (71%), mientras que las mutaciones nonsense en la cadena liviana del FVIII, los frameshifts, la Inv22, las nonsense sobre la cadena pesada y las missense, riesgos decrecientes. La determinación de la mutación causal constituye una información valiosa para el asesoramiento genético de las familias afectadas y para el diseño específico individual de la terapia.