Análisis estructural in silico de cambios moleculares en el FVIII asociados a variantes patogénicas tipo missense en pacientes con hemofilia A no severa que muestran discrepancias de FVIII:C entre ensayos de una etapa y cromogénicos.

ROSSETTI L, ARIAS M, SUELDO E, ZIEGLER B, MARCHIONE V, RADIC P, ABELLEYRO M, BAQUÉS A, DE BRASI C

Capital Federal

Congreso; XV Congreso Argentino de Hemostasia y Trombosis CAHT 2022; 2022

Grupo CAHT 2022

Introducción: La hemofilia A (HA) se asocia con una deficiencia cualitativa o cuantitativa del factor VIII de coagulación (FVIII). Alrededor de un tercio de los pacientes con HA no-severa presentan variantes tipo missense específicas, que muestran resultados discrepantes entre los niveles de actividad de FVIII (FVIII:C) medidos por ensayo Coagulométrico en una etapa (FVIIIcoag) o por ensayo Cromogénico (FVIIIcro). Objetivos: Analizar los posibles mecanismos subyacentes a la discrepancia de FVIII:C, entre FVIIIcoag y FVIIIcro en cinco pacientes con variantes missense causantes de HA mediante análisis estructural in silico.Materiales y Métodos: Se incluyeron cinco pacientes con HA no-severa de cuatro familias que presentaron resultados discrepantes en las muestras (FVIIIcoag/FVIIIcro≤0.5 ó FVIIIcoag/FVIIIcro≥2.0). FVIII:C por FVIIIcoag y FVIIIcro se determinaron usando dos sistemas de reactivo/coagulómetro, IL/ACL Top 300 y Siemens/Sysmex CS-2500. Genotipificación: a partir de ADN genómico extraído de leucocitos se examinó la presencia de variantes en el gen del FVIII (F8) mediante amplificación por PCR de todas las regiones codificantes y reguladoras de F8 seguido de CSGE (electroforesis en gel sensible a la conformación) y los amplímeros seleccionados se caracterizaron mediante secuenciación de Sanger. La patogenicidad de las variantes encontradas en F8 se clasificó de acuerdo con los criterios de la ACMG utilizando la base de datos internacional de variantes F8, EAHAD (Asociación Europea de Hemofilia y Trastornos Afines). El análisis estructural en 3D de las variantes missense se realizó in silico utilizando recursos disponibles públicamente (Figura).Resultados: Se identificaron cuatro variantes missense causantes de HA no-severa en los 5 pacientes de Argentina: una ubicada en el dominio FVIII-C1 y cuatro en el dominio FVIII-A3. Ninguno de ellos se asoció previamente con discrepancia de ensayos en EAHAD. El análisis in silico reveló diversos tipos de daños estructurales de proteínas en las variantes missense (Figura), que respaldan su impacto diferencial en la pérdida de función del FVIII y cambios en la región que explican la discrepancia observada en el nivel de FVIIIcoag>FVIIIcro.Conclusiones: Nuestros resultados respaldan la utilidad de complementar los estudios genéticos de variantes patogénicas missense en pacientes afectados de HA que muestran discrepancia en el ensayo de FVIII:C (FVIIIcoag vs FVIIIcro) con análisis estructurales in silico del impacto molecular sobre la proteína de FVIII, para mejorar el diagnóstico, la interpretación de discrepancia en el ensayo de FVIII:C y evaluación correcta del grado de severidad de la HA.