Protección de péptidos de amaranto frente al stress oxidativo de células Caco-2.

ORSINI C,, AÑÓN MC Y TIRONI VA

Córdoba

Congreso; V Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CICYTAC 2014); 2014

Secretaría de Ciencia y Tecnología, Gobierno de Córdoba

El estudio de antioxidantes naturales es importante dado que en nuestro organismo se producen daños oxidativos debido a la presencia de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno (ROS y RNS). En estudios previos hemos demostrado la capacidad de péptidos generados por la digestión gastrointestinal simulada de proteínas de Amaranthus mantegazzianus para neutralizar ROS y RNS en sistemas in vitro acelulares. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dichos digeridos y sus fracciones peptídicas, sobre la oxidación inducida por ROS en células de carcinoma de colon humano (Caco-2-TC7). Para ello, se sometieron un aislado proteico (A) y su hidrolizado con alcalasa (H) a una digestión gastrointestinal simulada (pepsina, pH 2, 1h, 37ºC, agitación; pancreatina, pH 6, 1h, 37ºC, agitación), obteniéndose los digeridos Ad y Hd. Los mismos fueron analizados y separados mediante cromatografía de exclusión molecular (FPLC, columna Superdex 30, cutt-off: 10kDa), colectándose fracciones. Para evaluar la actividad citoprotectora de A, H, Ad y Hd se sembraron células Caco-2-TC7 en placas de 48 fosas, luego de 72 h de crecimiento, fueron incubadas en presencia de las muestras durante 1 h (37ºC, 5% de CO2); se eliminaron las muestras, se lavó con PBS y se adicionó 2,7 dihidrodiclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) el cuál es capaz de penetrar las células y transformarse en DCFH; luego de 1h de incubación, se retiró el exceso de sonda, se lavó con PBS y se adicionó 2,2´-Azo-bis-(2-metilpropionamidina) dihidrocloruro (AAPH) (generador de radicales peroxilo); se midió la fluorescencia generada por oxidación de DCFH (λexc = 485nm, λem = 528nm) durante 3 h cada 5 min (37 ºC), evaluándose la inhibición de los radicales libres respecto a los correspondientes sistemas control. Paralelamente, se evaluó el efecto citotóxico de las muestras mediante el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT.) Las cuatro muestras ensayadas presentaron cierto grado de protección frente a la oxidación de las células, siendo este efecto dependiente de la concentración proteica. Para una concentración de 2,5 mg de proteína/ml, los % de inhibición de la formación de ROS fueron 21 ± 6 y 31 ± 6 para A y Ad respectivamente, y 29 ± 5 y 35 ± 1 para H y Hd. La digestión gastrointestinal simulada potenció el efecto protector en ambos casos. Las fracciones separadas mediante FPLC que habían sido previamente seleccionadas por presentar mayor capacidad para neutralizar radicales libres mediante los ensayos ORAC y HORAC también demostraron actividad citoprotectora.