CARACTERIZACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae COMO PROBIOTICOS Y DECONTAMINANTES DE MICOTOXINAS

ARMANDO R., ; PIZZOLITO R., ; PEIRANO S., ; PEREYRA C., ; DALCERO A., ; CAVAGLIERI L.

Río de Janeiro, Brasil

Congreso; XIII ENCUENTRO INTERNACIONAL DE MICOTOXINAS; 2008

07 - CARACTERIZACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae COMO PROBIÓTICOS Y DECONTAMINANTES DE MICOTOXINAS MARÍA R. ARMANDO, ROMINA PIZZOLITTO, MARÍA S. PEIRANO, CARINA PEREYRA, ANA M. DALCERO, LILIA CAVAGLIERI Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta 36 km 601 (5800) Río Cuarto – Córdoba – ARGENTINA rarmando@exa.unrc.edu.ar Abstract. Mycotoxins are natural contaminants affecting pig production. One promising alternative is the use of functional foods containing probiotics capable to exert beneficial effects in animals. The objectives of this study were 1) isolate and characterize strains of Saccharomyces cerevisiae from feedstuff, feces and pig guts, 2) to analyze the probiotic strains as potential sorbents of ochratoxin A (OTA) and aflatoxin B1 (AFB1). Resumen. Las micotoxinas son contaminantes naturales que afectan la producción porcina. Una alternativa promisoria es el uso de alimentos funcionales que contengan microorganismos probióticos capaces de ejercer efectos benéficos en el animal que los consume. Los objetivos del presente trabajo fueron 1) aislar y caracterizar cepas de Saccharomyces cerevisiae de alimento balanceado, intestinos y materia fecal de cerdo, 2) analizar la capacidad de las cepas potencialmente probióticas de adsorber ocratoxina A (OTA) y aflatoxina B1 (AFB1). Palabras clave. Levaduras, probióticos, adsorción de micotoxinas Introducción. Las micotoxinas son contaminantes naturales que afectan la producción porcina reduciendo la expectativa de vida y produciendo grandes pérdidas económicas (CAST 2003). Décadas de investigación han desarrollado estrategias para la eliminación de las micotoxinas de ingredientes y alimentos terminados cuya aplicación no ha sido exitosa debido a los altos costos o las dificultades prácticas en el proceso de detoxificación. Una alternativa promisoria es el uso de alimentos funcionales que contengan microorganismos probióticos capaces de ejercer efectos benéficos en el animal que los consume, permitiendo mejorar la eficiencia de conversión alimenticia, como promotores de crecimiento. La reducción de la exposición de los cerdos a las micotoxinas disminuye por lo tanto los riesgos en la salud animal y humana (Kühle y col. 2004). Los objetivos del presente trabajo fueron 1) aislar y caracterizar cepas de Saccharomyces cerevisiae de alimento balanceado, intestinos y materia fecal de cerdo, 2) analizar la capacidad de las cepas potencialmente probióticas de adsorber ocratoxina A (OTA) y aflatoxina B1 (AFB1). Materiales y Métodos Aislamiento de levaduras. Se aislaron 6 cepas de levaduras a partir de muestras de alimento balanceado (2), intestino (2) y materia fecal (2) de cerdo. Las muestras de alimento se obtuvieron a partir del método de Fraga et al. (2007). Diez gramos de muestra se adicionaron a 90 ml. de agua peptonada 0.1% (w/v) y se incubaron  en agitación  por 30 min a 25ºC. Se realizaron 6 diluciones seriadas y 100 µl de cada dilución se inocularon por duplicado en agar levadura-peptona-dextrosa (YPD). Las placas fueron incubadas por 48 h. a 25 ºC. Muestras de intestino y de materia fecal de cerdo se incubaron en caldo YPD durante 48 h a 37 ° C. Cien µl de cada muestra se sembraron por duplicado en YPD. Las placas se incubaron durante 48 h. a 37°C. Ensayo de sensibilidad a antibióticos (cloranfenicol, estreptomicina  y neomicina). Se determinó por el método de difusión según Olsson-Liljequist y col. (1997). Tolerancia a bajo pH y presencia de sales biliares. Según Van der Aa Kuhle y col. (2004). Ensayo de autoagregación. Se realizó según Roos y col. (1999). Ensayo de Congregación. Se estudió la capacidad de coagregación entre cepas de levaduras y bacterias enteropatógenas: S. epidermidis; S. aureus; B. subtilis; E.coli; Enterobacter sp.; Klebsiella sp.; Pseudomona sp. El ensayo se realizó de acuerdo a Mastromarino y col. (2002). Ensayo de actividad antimicrobiana. Las levaduras se incubaron en caldo YPD a 37ºC durante 24 hs. Con cada cepa se realizó una estría central de levadura en placas con medio YPD. Se incubó a 37ºC durante 48 hr. Se colocó una capa delgada de  YPD y, una vez solidificado, se realizaron estrías con diferentes patógenos: Salmonella sp, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus sp, Pseudomona sp. Se incubaron a 37ºC durante 24 hr. Detección y cuantificación de OTA. Se siguió la metodología de Scudamore y McDonald (1998). Ensayo de adsorción de AFB1. Las cepas de S. cerevisiae crecieron en medio YPD a 37ºC durante 24 h. Luego se centrifugaron a 5000 x g durante 15 min, se descartó el sobrenadante y se lavó el pellet tres veces con solución de buffer fosfato (PBS). La AFB1 se suspendió en benceno:acetonitrilo (98:2 v/v), se tomaron los volúmenes necesarios para llegar a las concentraciones 50, 100 y 500 µg/ kg. El solvente se evaporó bajo N2 y se resuspendió en metanol. Los pellets de levaduras se resuspendieron en PBS para obtener la concentración de microorganismos deseada y se incubaron con agitación a 37ºC durante 30 min. Luego se centrifugaron a 5000 x g durante 15 min. Se colectaron los sobrenadantes conteniendo la AFB1 no unida, y se cuantificaron por HPLC (Trucksess y col. 1994 y AOAC 1995). Resultados    Tabla 1: Identificación de cepas de levaduras                Tabla 2: Ensayo de sensibilidad a antibióticos. +, zona inhibición ≤ 9 mm y ≥ 3 mm; ++, zona inhibición ≤ 15 y ≥ 10 mm; -, zona inhibición ≤ 3 S. cerevisiae Actividad antimicrobiana E. coli Salmonella sp Pseudomonas sp Enterobacter sp S. aureus RC008 ++ ++ ++ ++ ++ RC009 - - - - - RC012 + + + + + RC016 ++ ++ ++ ++ ++ RC017 - ++ + + - RC029 - - - - - Cepas de S. cerevisiae Adsorción de OTA (%) RC008 RC012 RC016 70 64 65.5 Límite de detección 5 ng g-1.; levadura 1.107 cél/ml; OTA 2 ng/ml Límite de detección 1 ng g-1.; levadura 1.107 cél/ml Cepas de S. cerevisiae Adsorción de AFB1 (%) 50 µg/ kg 100 µg/ kg 500 µg/ kg RC008 94,7 62,6 54,9 RC009 39,2 51,1 76,0 RC012 78,0 54,4 53,2 RC016 90,3 53,6