Generación de plataformas analíticas para la certificación de productos libres de gluten

DOÑA V; ZAIDMAN V; URRUTIA M; GOLDBAUM F; CHIRDO F

Buenos Aires

Congreso; 2do Simposio Latinoamericano de Enfermedad Celíaca; 2009

2do Simposio Latinoamericano de Enfermedad Celíaca

Introducción: En enfermedad celíaca, la dieta libre de gluten es el único tratamiento efectivo. Aunque no ha sido posible identificar en forma inequívoca los niveles máximos tolerables, el empleo de métodos de alta capacidad de detección para la certificación de alimentos libres de gluten es fundamental para brindar mayor seguridad a los pacientes. Diversas interferencias técnicas afectan la cuantificación de prolaminas en muy bajos niveles y dificultan la obtención de resultados confiables.    Objetivo: Generar nuevas plataformas analíticas de alto poder de detección para la certificación de productos libres de gluten. Materiales y Métodos: Desarrollos previos nos permitieron contar con una biblioteca de expresión en fagos de fragmentos VHHs de Llama. De allí, se seleccionaron los clones más adecuados, que también fueron producidos en forma recombinante. Por otro lado, se optimizó un ensayo de amplificación combinado (Immuno-PCR) empleando tanto anticuerpos convencionales como fragmentos VHHs. Resultados: Se obtuvo una biblioteca de fragmentos VHH de Llama específicos de gliadinas, de la cual se seleccionaron los clones con mayor estabilidad fisicoquímica para el  desarrollo de ensayos cuantitativos. El ELISA de captura empleando el clon VHH26 tiene un límite de detección de 3,5 ng gliadinas/ml (0,015 ppm) para el fago y 6 ng/ml (0,025 ppm) para el fragmento soluble El uso de fragmentos estables en condiciones desnaturalizantes permitió obtener un ensayo funcional en presencia de una concentración final de 15% de etanol. Basado en un ensayo de captura se optimizó un sistema de amplificación empleando PCR en tiempo real (Inmuno-PCR). Usando los pares 1B4/2A1 se obtuvo una significativa amplificación de señal (0,05 ng/ml, 0,001 ppm) aumentando 20 veces la detección. Mientras que con el VHH26 soluble se obtuvo un aumento de 30 veces en la detección (0,2 ng/ml, 0,0008 ppm). Los ensayos fueron evaluados frente a un panel de muestras comerciales mostrando alta eficiencia analítica y superior detectabilidad a los ensayos en uso. Conclusión: Se generaron varias plataformas analíticas con mayor capacidad de detección que los métodos actualmente en uso para la certificación de los productos  libres de gluten.